A senescência celular, o estado irreversível de paragem do ciclo celular, pode ser induzida por vários stresses celulares. Aqui, descrevemos os protocolos para induzir a senescência e métodos celular para avaliar marcadores de senescência.
Em resposta ao stress celular ou dano, as células em proliferação podem induzir um programa específico que inicia um estado de paragem do ciclo celular a longo prazo, denominado senescência celular. A acumulação de células senescentes ocorre com o envelhecimento do organismo e por meio de cultura contínua in vitro. As células senescentes influenciam diversos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, reparação e regeneração de tecidos, supressão de tumores, e o envelhecimento. Características das células senescentes incluem, mas não estão limitados a, um aumento da actividade β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal); p16 ink4a, p53, e p21 níveis; níveis mais elevados de danos no ADN, incluindo γ-H2AX; a formação de senesccia associada Heterocromatina Focos (SAHF); e a aquisição de um associado com a senescência secretora Fenótipo (SASP), um fenómeno caracterizado pela secreção de um número de citocinas pró-inflamatórias e as moléculas de sinalização. Aqui, descrevemos os protocolos tanto para replicativo esenescência danificam o ADN induzida em células de cultura. Além disso, podemos destacar as técnicas de controlo do fenótipo senescente utilizando vários marcadores associada com a senescência, incluindo SA-β-gal, γ-H2AX e coloração SAHF, e para quantificar os níveis de proteína e ARNm de reguladores do ciclo celular e factores de SASP. Estes métodos podem ser aplicados para a avaliação da senescência em vários modelos e tecidos.
Mais de meio século atrás, Hayflick e colegas descreveram como células não transformadas proliferar em cultura, mas apenas por um período limitado de tempo 1. cultura de longo prazo de fibroblastos humanos causado as células para parar a proliferar; no entanto, eles foram metabolicamente ativo, e este foi chamado senescência celular. Senescência pode ser benéfica para inibir tumorigênese, mas também pode ser prejudicial, como é pensado para contribuir para a perda de capacidade de regeneração que ocorre com o envelhecimento 2, 3. As células senescentes foram mostrados a acumular-se em tecidos como os seres humanos 4 anos de idade e têm sido implicadas num certo número de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, reparação de tecidos, e inflamação relacionada com a idade 2.
passagem contínua de células em cultura induz a senescência replicativa, que tem sido associadapara telômero atrito e instabilidade genômica. Várias tensões de células, incluindo danos no DNA e oncogenes, pode também causar a senescência 3. Senescência causada por outros que o atrito dos telómeros factores é muitas vezes chamado induzida pelo stress ou senescência prematura e geralmente depende da INK4A p16 / Rb via da 5. Embora a proliferação, as células não transformadas geralmente aparecem eixo em forma, as células senescentes pode ser identificado como tendo certas características, incluindo um, grande morfologia plana e aumento da actividade β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (Figuras 1 e 2). As células senescentes também acumular marcadores de dano de ADN, incluindo γ-H2AX (Figura 3) 6, e, potencialmente, associada à senescência heterocromatina focos (SAHF) (Figura 4) 7. As células senescentes tem níveis mais elevados de reguladores do ciclo celular, incluindo p 16 (INK4A p16) e / ou p21 e p53 (Figura 5) 8, 9. Além disso, dados recentes têm mostrado que as células senescentes pode ter efeitos não autónomos através da secreção de uma série de citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas chamado o associada à senescência secretora fenótipo (SASP) 10. Embora este fenómeno SASP pode variar de tipo de célula para tipo de célula, em geral, é demonstrado por um aumento da interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), growth- α regulado oncogene (GRO-α), e GRO-β, entre outros (Figura 6). O esforço particular ou danos que induz senescência também pode influenciar o fenótipo secretor 11, 12, 13. SASP pode ser detectada através da medição dos níveis de proteínas segregadas utilizando ELISA ou matrizes de citoquinas / proteínass = "xref"> 10, 14. Apesar de mecanismos de pós-transcricional pode regular os níveis de proteína SASP 11, 15, 16, 17, as alterações nos níveis de ARNm pode também ser detectada em muitos casos. Estas alterações são, geralmente, mais sensível e mais fácil de quantificar do que as medições de nível de proteína. Outros marcadores senescentes também pode ser avaliada, incluindo danos no DNA focos nuclear persistente, chamados segmentos de ADN com alterações na cromatina de reforço senescência (ADN-CICATRIZES) 18, e vários outros marcadores de 3, 19, 20.
Aqui, nós descrevemos técnicas comuns para induzir a senescência em células em cultura e também para a medição de vários marcadores de senescência, incluindo SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, e a proteína e ARNm de senescemoléculas dno-associado.
Aqui, nós descrevemos métodos para replicativa e a DNA-danos senesccia induzida utilizando fibroblastos diplóides humanos. Além disso, as técnicas para quantificar os níveis de mRNA de várias proteínas associadas com a senescência proteína e estão incluídos, bem como a coloração para SA-β-gal e para a ADN-danos marcador γ-H2AX. Estes protocolos podem ser amplamente utilizada para avaliar os fenótipos senescentes tanto in vitro como in vivo, embora existam muitas advertências para a ca…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional sobre Envelhecimento. Os autores agradecem a Myriam Gorospe e Kotb Abdelmohsen para muitas discussões úteis sobre senescência e Kotb Abdelmohsen para também leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também a nossos membros de laboratório, especialmente Douglas Dluzen pela leitura crítica do manuscrito.
16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 |