Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar
Summary
La senescencia celular, el estado irreversible de la detención del ciclo celular, puede ser inducida por diferentes tipos de estrés celular. A continuación, describimos protocolos para inducir senescencia y métodos celular para evaluar marcadores de senescencia.
Abstract
En respuesta a estrés celular o daño, las células proliferantes pueden inducir un programa específico que inicia un estado de detención del ciclo celular a largo plazo, denominado senescencia celular. La acumulación de células senescentes se produce con el envejecimiento del organismo y por medio de cultivo continuo in vitro. Las células senescentes influyen en muchos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos y la regeneración, la supresión de tumores, y el envejecimiento. Características de las células senescentes incluyen, pero no se limitan a, aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal); INK4a p16, p53, y p21 niveles; mayores niveles de daño del ADN, incluyendo γ-H2AX; la formación de asociada a senescencia heterocromatina Foci (SAHF); y la adquisición de un fenotipo secretor asociada a la senescencia (SASP), un fenómeno que se caracteriza por la secreción de una serie de citoquinas pro-inflamatorias y moléculas de señalización. A continuación, describimos los protocolos para ambos replicativa ysenescencia daño en el DNA inducida en células cultivadas. Además, destacamos técnicas para controlar el fenotipo senescente utilizando varios marcadores asociados con la senescencia, incluyendo SA-β-gal, γ-H2AX y tinción SAHF, y para cuantificar los niveles de proteína y ARNm de reguladores del ciclo celular y factores de SASP. Estos métodos se pueden aplicar a la evaluación de la senescencia en varios modelos y tejidos.
Introduction
Hace más de medio siglo, Hayflick y sus colegas describen cómo las células no transformadas proliferen en cultivo, pero sólo durante un periodo finito de tiempo 1. el cultivo a largo plazo de fibroblastos humanos hizo que las células para detener la proliferación; sin embargo, eran metabólicamente activa, y esto fue llamado senescencia celular. La senescencia puede ser beneficioso para la inhibición de la tumorigénesis, pero también puede ser perjudicial, ya que se cree que contribuyen a la pérdida de capacidad de regeneración que se produce con el envejecimiento 2, 3. Las células senescentes se han demostrado que se acumulan en los tejidos como humanos 4 edad y han sido implicados en una serie de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, y la inflamación 2 relacionada con la edad.
passaging continua de las células en cultivo induce senescencia replicativa, que se ha relacionadoa telómero desgaste y la inestabilidad genómica. Diversas tensiones de células, incluyendo daño en el ADN y oncogenes, también pueden causar la senescencia 3. La senescencia causado por factores distintos de desgaste de los telómeros se llama a menudo inducida por el estrés o la senescencia prematura y generalmente depende de la INK4A p16 / Rb ruta de la 5. Aunque la proliferación, las células no transformadas aparecen típicamente husillo en forma, las células senescentes pueden ser identificados como que tiene ciertas características, incluyendo una, gran morfología plana y aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) (Figuras 1 y 2). Las células senescentes también se acumulan marcadores de daño de ADN, incluyendo γ-H2AX (Figura 3) 6, y, potencialmente, asociada a la senescencia heterocromatina focos (SAHF) (Figura 4) 7. Las células senescentes tienen mayores niveles de los reguladores del ciclo celular, incluyendo p 16 (INK4A p16) y / o p21 y p53 (Figura 5) 8, 9. Además, datos recientes han demostrado que las células senescentes pueden tener efectos no autónomos mediante la secreción de una serie de citocinas y quimiocinas pro-inflamatoria llamada la asociada a la senescencia secretora fenotipo (SASP) 10. Aunque este fenómeno SASP puede variar de tipo celular a tipo celular, en general, se demuestra por un aumento de la interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), crecimiento- α regulado oncogén (GRO-α), y GRO-β, entre otros (Figura 6). El estrés o daño particular que induce la senescencia también pueden influir en el fenotipo secretor 11, 12, 13. SASP puede ser detectado mediante la medición de los niveles de proteínas secretadas utilizando ELISAs o matrices citoquina / proteínas = "xref"> 10, 14. Aunque los mecanismos post-transcripcionales pueden regular los niveles de proteína SASP 11, 15, 16, 17, los cambios en los niveles de mRNA también pueden detectarse en muchos casos. Estos cambios son generalmente más sensibles y más fácil de cuantificar que las mediciones de nivel de proteínas. Otros marcadores senescentes también pueden ser evaluados, incluyendo persistente daño en el ADN focos nucleares, denominados segmentos de ADN con alteraciones de la cromatina de refuerzo senescencia (DNA-cicatrices) 18, y diversos otros marcadores 3, 19, 20.
A continuación, describimos técnicas comunes para la inducción de la senescencia en células en cultivo y también para la medición de varios marcadores de senescencia, incluyendo SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, y la proteína y ARNm de senescenciamoléculas NCE-asociado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos descrito métodos para replicativa y daño de ADN inducido por senescencia utilizando fibroblastos diploides humanos. Además, las técnicas para la cuantificación de proteínas y niveles de ARNm de varias proteínas de la senescencia asociado se incluyen, así como tinción para SA-β-gal y para el marcador de daño de ADN γ-H2AX. Estos protocolos pueden ser ampliamente utilizados para evaluar fenotipos senescentes tanto in vitro como in vivo, aunque existen muchas advertencias para la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los autores desean agradecer a Myriam Gorospe y Kotb Abdelmohsen útil para muchos debates sobre la senescencia y Kotb Abdelmohsen para también la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos también a los miembros de nuestro laboratorio, especialmente Douglas Dluzen para la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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