Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande
Summary
Cellulärt åldrande, den irreversibla tillstånd av cellcykelstopp, kan induceras genom olika cellulära påkänningar. Här beskriver vi protokoll för att framkalla cellulärt åldrande och metoder för att bedöma markörer för åldrande.
Abstract
Som svar på cellulär stress eller skada, kan prolifererande celler inducerar ett specifikt program som initierar ett tillstånd av långsiktig cellcykelstopp, benämnd cellulärt åldrande. Ackumulering av åldrande celler inträffar med organism åldrande och genom ständig odling in vitro. Åldrande celler påverkar många biologiska processer, inklusive embryoutveckling, vävnad reparation och förnyelse, tumörundertryckning, och åldrande. Kännetecken åldrande celler innefattar, men är inte begränsade till, ökad senescens-associerade β-galaktosidasaktivitet (SA-β-gal); p16 INK4a, p53, och p21-nivåer; högre nivåer av DNA-skada, inklusive γ-H2AX; bildandet av Åldrande-associerad heterochromatin Foci (SAHF); och förvärvet av en Åldrande associerat Sekretorisk Fenotyp (SASP), ett fenomen som kännetecknas av utsöndring av ett antal pro-inflammatoriska cytokiner och signalmolekyler. Här beskriver vi protokoll för både replika ochDNA-skada-inducerad senescens i odlade celler. Dessutom belyser vi tekniker för att övervaka senescent fenotypen med användning av flera hudåldrande-associerade markörer, inklusive SA-β-gal, γ-H2AX och SAHF färgning, och för att kvantifiera protein och mRNA-nivåer av cellcykelregulatorer och SASP faktorer. Dessa metoder kan tillämpas vid bedömningen av åldrande i olika modeller och vävnader.
Introduction
Mer än ett halvt sekel sedan, Hayflick och kollegor beskrev hur otransformerade celler förökar sig i kultur, men för bara en begränsad tid en. Långsiktig odling av humana fibroblaster orsakade cellerna att stoppa prolifererande; men de var metaboliskt aktiva, och detta kallades cellulärt åldrande. Senescens kan vara fördelaktigt för att hämma tumörgenes, men det kan också vara skadligt, eftersom det är tänkt att bidra till förlust av regenerativ kapacitet som uppstår med åldrandet 2, 3. Åldrande celler har visat sig ackumuleras i vävnader som människor ålder 4 och har varit inblandade i ett antal biologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning, vävnadsreparation, och åldersrelaterad inflammation 2.
Kontinuerlig passage av celler i kultur inducerar replikativ senescens, vilket har kopplatsatt telomer attrition och genomisk instabilitet. Olika cellspänningar, inklusive DNA-skador och onkogener, kan också orsaka senescens 3. Senescens orsakas av andra än telomer attrition faktorer kallas ofta stressinducerad eller för tidig senescens och i allmänhet beror på p16 INK4a / Rb-vägen 5. Fastän prolifererande, otransformerade celler visas normalt spindel i form, kan åldrande celler identifieras såsom att ha vissa egenskaper, innefattande en platt, stor morfologi och ökade senescens-associerade β-galaktosidasaktivitet (SA-β-gal) (figurerna 1 och 2). Åldrande celler ackumuleras även DNA skada markörer, inklusive γ-H2AX (figur 3) 6, och, potentiellt, senescens-associerade heterokromatin foci (SAHF) (Figur 4) 7. Åldrande celler har högre nivåer av cellcykelregulatorer, inklusive p 16 (p16 INK4a) och / eller p21 och p53 (fig 5) 8, 9. Dessutom har nya data visat att åldrande celler kan ha icke-autonoma effekter genom att utsöndra ett antal pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner som kallas senescens-associerade sekretorisk fenotyp (SASP) 10. Även om denna SASP fenomen kan variera från celltyp till celltyp, i allmänhet är det visas genom en ökning av interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF), tillväxt- reglerad onkogen α (GRO-α) och GRO-β, bland andra (Figur 6). Den speciella stress eller skada som inducerar senescens kan också påverka den sekretoriska fenotypen 11, 12, 13. SASP kan detekteras genom att mäta nivåerna av utsöndrade proteiner med användning av ELISA eller cytokin / proteinchips = "xref"> 10, 14. Även om post-transkriptionella mekanismer kan reglera SASP proteinnivåer 11, 15, 16, 17, förändringar i mRNA-nivåer kan också detekteras i många fall. Dessa förändringar är i allmänhet känsligare och lättare att kvantifiera än mätningar proteinnivå. Andra åldrande markörer kan också bedömas, inklusive ihållande DNA-skada nukleärt foci, som kallas DNA-segment med kromatin förändringar armerings senescens (DNA-SCARS) 18, och diverse andra markörer 3, 19, 20.
Här beskriver vi vanliga tekniker för att inducera senescens i celler i odling och även för mätning av flera markörer för åldrande, inklusive SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, och proteinet och mRNA av åldrasiou-associerade molekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, har vi beskrivit metoder för replikativ och DNA-skada inducerad senescens som använder humana diploida fibroblaster. Dessutom är tekniker för att kvantifiera protein och mRNA-nivåer av olika hudåldrande associerade proteiner inkluderas, liksom färgning för SA-β-gal och för DNA-skador markör γ-H2AX. Dessa protokoll kan ofta används för att bedöma senescenta fenotyper både in vitro och in vivo, även om många varningar existerar för karakterisering senescens in vivo <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Intramural forskningsprogram National Institutes of Health, National Institute on Aging. Författarna vill tacka Myriam Gorospe och Kotb Abdelmohsen för många hjälp diskussioner om åldrande och Kotb Abdelmohsen för också kritiskt läsa manuskriptet. Vi tackar också våra laboratorie medlemmar, särskilt Douglas Dluzen för kritiskt läsa manuskriptet.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
References
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
- Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
- Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
- Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
- Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
- Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
- Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
- Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
- Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
- Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
- Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
- Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
- Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
- Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
- Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
- Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase–an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
- Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
- Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
- Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
- Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).
