Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Il raggiungimento di rigenerazione degli assoni dopo una lesione del sistema nervoso è un compito impegnativo 1. Per studiare il fallimento della rigenerazione assonale nel sistema nervoso centrale (SNC), i ricercatori hanno usato una pletora di modelli di lesioni nervose. Come regioni del SNC differiscono, è importante utilizzare un modello anatomicamente appropriato per studiare la rigenerazione assonale. Utilizzando il modello appropriato, i ricercatori possono formulare una terapia specifica in base alla gravità del danno, il tipo di cellule neuronali di interesse, e il tratto della colonna vertebrale desiderato per valutare la rigenerazione, al contrario di una strategia di trattamento "uno-per-tutti".
Lesioni del midollo spinale, per esempio, i sintomi più debilitanti derivano dalla perdita di sensibilità e locomozione. Perdita di sensibilità è causata da un danno ai percorsi sensoriali ascendente, mentre la perdita di locomozione è causata da un danno alle vie motorie discendenti. A causa di differenze cellulari e anatomiche tra questi two percorsi, molti studi di rigenerazione degli assoni mirati concentrano solo su uno o l'altro percorso, con la motivazione che il successo di recupero di entrambi sarebbe di enorme beneficio per i pazienti. In questo articolo, presentiamo un protocollo che utilizza un'iniezione diretta gangli della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e un concomitante radice dorsale lesione da schiacciamento nella inferiore cervicale midollo spinale di ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione assonale sensoriale.
DRG neuroni sensoriali sono responsabili per la trasmissione di informazioni sensoriali, come la sensazione tattile e il dolore, dalla periferia al SNC. Le lunghe proiezioni assonale dei neuroni sensoriali del midollo spinale servire come un buon modello per studiare la rigenerazione degli assoni a lunga distanza. Inoltre, come roditori possono sopravvivere ad una lesione percorso sensoriale, come una lesione da schiacciamento radice dorsale con complicazioni assistenziali minimi, i ricercatori possono studiare la rigenerazione degli assoni del sistema nervoso centrale, senza la necessità di lesioni completamente il midollo spinale. Una quadrupla C5 – C8 (cervicale level 5 – 8) della radice dorsale lesione da schiacciamento ha dimostrato di essere un modello utile per forepaw deafferentazione 2. Inoltre, una dorsale lesioni radice schiacciamento fornisce un modello "pulito" per studiare la rigenerazione assonale di una lesione del midollo spinale diretta perché è complicata da altri fattori, quali la formazione della cicatrice gliale.
L'uso della terapia genica virale per riprogrammare i neuroni in uno stato rigenerativo è stata sempre considerata come una strategia di trattamento promettente per molte condizioni neurologiche 3. Gli studi hanno dimostrato l'applicazione di un vettore virus adeno-associato (AAV) portante il transgene di una proteina che favorisce la crescita può raggiungere rigenerazione assonale robusta con recupero comportamentale 4, 5, 6. La bassa patogenicità apparente di AAV nel provocare una risposta immunitaria e la capacità di trasdurre cellule che non si dividono, come i neuroni, rendonocosì il vettore ottimale per la terapia genica. Inoltre, il modulo AAV ricombinante è utilizzato per la terapia. In questa forma, è incapace di integrare suo genoma virale nel genoma dell'ospite 7, riducendo il rischio di mutagenesi inserzionale rispetto ad altri vettori virali, come lentivirus. Questo rende AAV una scelta sicura per applicazioni di terapia genica.
Come DRG contiene i corpi cellulari dei neuroni sensoriali, è il bersaglio anatomico più appropriata per la somministrazione del virus per la terapia genica di studiare e / o promuovere la rigenerazione assonale sensoriale. In uno studio comparativo differenti sierotipi di AAV e lentivirus, AAV sierotipo 5 (AAV5) ha dimostrato di essere il più efficiente in trasduzione neuroni DRG su un percorso tempo di almeno 12 settimane quando iniettato direttamente nel DRG 8. Inoltre, AAV può raggiungere più del 40% efficienza di trasduzione, trasduzione tutti i sottotipi neuronali DRG, come il grande diametro neurofilamenti 200 kDa(NF200) neuroni -positive e il piccolo diametro CGRP (CGRP) – o b4 isolectin (IB4) neuroni -positive 4, 8.
Poiché la procedura chirurgica di iniezione DRG e lesione da schiacciamento delle radici dorsali è estremamente invasivo e delicato, noi crediamo che questo articolo vi aiuterà i nuovi utenti ad imparare la procedura in modo molto efficiente. In questo articolo, mostriamo risultati rappresentativi di ratti adulti quattro settimane dopo l'iniezione di un virus controllo AAV5-GFP (proteina fluorescente verde) in C6 – C7 DRG con un concomitante C5 – C8 spinali lesione da schiacciamento. Questo modello è particolarmente adatto per i ricercatori che stanno indagando l'uso della terapia genica virale per promuovere la rigenerazione degli assoni sensoriali.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, presentiamo una guida passo-passo per eseguire un'iniezione DRG e lesione da schiacciamento radice dorsale in basso cervicale midollo spinale di ratto adulto. Poiché si tratta di un intervento chirurgico estremamente invasiva e delicata, si consiglia vivamente che tutti i potenziali utenti di ottenere la formazione e la pratica sufficiente prima di avanzare a vivere la chirurgia degli animali. Gli utenti dovrebbero avere familiarità non solo con l'anatomia del midollo spinale, ma anche con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Christopher and Dana Reeve Foundation, il Medical Research Council, il Consiglio europeo della ricerca ECMneuro, e il Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vorremmo esprimere la nostra più profonda gratitudine a Heleen Merel van 't Spijker e Justyna Barratt per la loro assistenza tecnica durante le riprese. Vorremmo ringraziare il Dott Elizabeth Moloney e il professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) per l'assistenza nella produzione di AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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