Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Sinir sistemi yaralanması sonrası akson rejenerasyonunu sağlanması zor bir iştir 1'dir. Merkezi sinir sisteminde (MSS) akson rejenerasyon başarısızlığını incelemek için araştırmacılar sinir yaralanması modelleri bir bolluk kullandık. MSS bölgeler farklı olarak, akson rejenerasyon çalışması için anatomik uygun modeli kullanmak önemlidir. Uygun bir model kullanarak, araştırmacılar, "tek için tüm" tedavi stratejisi karşıt olarak, yaralanma şiddetine, ilgili nöronal hücre tipine göre belirli bir tedavi ve rejenerasyon değerlendirmek için arzu edilen spinal kanal formüle edebilir.
omurilik yaralanması, örneğin, en zayıflatıcı semptomlar duyu ve hareket kaybı kaynaklanıyor. lokomosyon kaybı inen motor yolların hasar sonucu ise duyu kaybı, artan duyusal yolların hasar kaynaklanır. Nedeniyle bu tw arasındaki hücresel ve anatomik farklılıklarao yolları, birçok hedef akson rejenerasyonu çalışmaları sadece birinin başarılı kurtarma hastalara muazzam fayda olacağını gerekçe ile, bir ya da diğer yoluna odaklanmak. Bu makalede, bir viral vektör ve duyu aksonu rejenerasyonu araştırmak için bir model olarak bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanması ile direkt arka kök gangliyon (DRG) enjeksiyon kullanan bir protokol mevcut.
DRG duyu nöronları CNS'ye çevresinden, Dokunma duyusu ve ağrı gibi duyusal bilgilerin geçişi için sorumludur. omurilikte duyusal nöronların uzun akson çıkıntıların uzun mesafe akson rejenerasyonunu çalışmak için iyi bir model olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, kemirgenler bu tür minimal refah komplikasyonlu bir dorsal kök ezilme yaralanması gibi bir duyusal yol lezyonu yaşayabilir olarak, araştırmacılar tamamen omuriliği lezyon oluşturmak gerek kalmadan MSS akson rejenerasyon çalışması olabilir. Dörtlü C5 – C8 (servikal level 5-8) dorsal kök ezilme yaralanması ön pençe deaferentasyon 2 için yararlı bir model olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bir dorsal kök ezilme yaralanması böyle glial skar oluşumu gibi diğer faktörler tarafından -komplikasyonsuz çünkü doğrudan omurilik yaralanması daha akson rejenerasyonu incelemek için "daha temiz" modelini sağlamaktadır.
Bir rejeneratif duruma nöronların yeniden programlamak için, viral gen terapisinin kullanımı giderek daha çok nörolojik durumlar 3 için umut verici bir tedavi stratejisi olarak kabul edilmiştir. Çalışmalar davranışsal iyileşme 4, 5, 6, sağlam akson rejenerasyonunu elde edebilirsiniz büyümeyi teşvik edici bir protein transgeni taşıyan bir adeno-bağlantılı virüs (AW) vektörü uygulanmasını göstermiştir. bir bağışıklık yanıtı ve nöronlar gibi bölünmeyen hücreleri transdüse yeteneğini ortaya çıkarmak AAV'nin belirgin düşük patojenik yapmakBu gen terapisi için uygun vektör. Buna ek olarak, rekombinant AAV bir şekilde tedavisi için kullanılır. Bu formda, bu, konakçı genomu 7 içine viral genomu entegre gibi lentivirüs gibi diğer viral vektörler ile karşılaştırıldığında girmeyle mutagenez riski azaltmanın kabiliyetine sahip değildir. Bu AAV gen tedavisi uygulamaları için güvenli bir seçim yapar.
bir DRG duyu nöronlarının hücre kütleleri içeri olarak, çalışma ve / veya duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek gen terapisi için virüsün tatbik için en uygun anatomik bir hedeftir. Kodlayan farklı AAV serotip ve lentivirüs karşılaştıran bir çalışmada, AAV serotip 5 (AAV5) DRG 8 enjekte edilmesi halinde, en az 12 haftalık bir süre boyunca DRG nöronlarını transdüse edilmesinde en etkili olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, AAV gibi büyük çaplı nörofilaman 200 kDa olarak tüm DRG nöronal alt tipleri, iletici fazla% 40 dönüşüm verimliliğini elde edebilirsiniz(NF200) pozitif nöronların küçük çaplı kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) – ya da isolectin b4 (IB4) pozitif nöronların 4, 8.
DRG enjeksiyonu ve dorsal kök ezilme yaralanması cerrahi prosedür olarak son derece invaziv ve narin, biz bu makalede, yeni kullanıcıların çok verimli bir şekilde prosedürünü öğrenmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. C8 dorsal kök ezilme yaralanması – eşzamanlı C5 C7 DRG'ler – Bu yazıda, yetişkin dört hafta C6 bir kontrol virüsü AAV5-GFP (yeşil floresan protein) enjeksiyonundan sonra farelerde temsil edici sonuçlar göstermektedir. Bu model, duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek için, viral gen terapisinin kullanımı soruşturma araştırmacılar için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord bir DRG enjeksiyon ve dorsal kök ezilme yaralanması gerçekleştirmek için adım adım kılavuzu mevcut. Bu son derece invaziv ve hassas cerrahi olduğu için, şiddetle tüm potansiyel kullanıcılar hayvan ameliyatı yaşamaya ilerlemeden önce yeterli eğitim ve uygulama elde öneririz. Kullanıcıların omurilik anatomisi ile değil, aynı zamanda çevredeki kas dokularının, omurga kemik yapısı ve damar sistemine sahip sadece aşina olmalıdır. İde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Christopher ve Dana Reeve Vakfı, Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Araştırma Konseyi ECMneuro ve Cambridge NHMRC Biyomedikal Araştırma Merkezi tarafından finansal olarak desteklenmiştir. Biz çekimler sırasında kendi teknik yardım için Heleen Merel van 't Spijker ve Justyna Barratt için en derin şükranlarımı istiyoruz. Biz AAV üretiminde yardımcı olmak için Doktor Elizabeth Moloney ve Profesör Joost Verhaagen (Nörobilim Hollanda Enstitüsü) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
