حبة المزدوجة والصفيف المغناطيس لصب ميكروويلس مع الهندسات مقعرة متغير
Summary
ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.
Abstract
ثقافة كروي أداة مفيدة لفهم سلوك الخلوية حيث أنه يوفر في فيفو–مثل البيئة ثلاثية الأبعاد. مختلف أساليب الإنتاج كروي مثل الأسطح غير لاصقة وقوارير غزل وقطرات معلقة وميكروويلس قد استخدمت في دراسات التفاعل خلية إلى خلية، وتنشيط جهاز المناعة، المخدرات الفرز، تنبع تمايز الخلية، وجيل أورجانويد. من بين هذه الأساليب، اكتسبت ميكروويلس مع هندسة مقعرة ثلاثي الأبعاد اهتمام العلماء والمهندسين، ونظرا لمزاياها من جيل كروي موحدة الحجم والسهولة التي يمكن أن تكون ردود الماغنيسيوم الفردية رصد. على الرغم من أن قد اقترحت طرق فعالة من حيث التكلفة مثل استخدام الأغشية المرنة والطباعة الحجرية الجليد، هذه التقنيات تحمل العيوب الخطيرة مثل صعوبة في السيطرة على أحجام نمط، تحقيق نسب عالية، وإنتاج مساحات أكبر من ميكروويلس. للتغلب على هذه المشاكل، فإننا نقترح وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. هذا الأسلوب يستخدم صفيف من خلال ثقب 30 × 30، عدة مئات ميكرومتر-أمر الصلب الخرز، والقوة المغناطيسية اختﻻق ميكروويلس 900 في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم. لإثبات انطباق لدينا طريقة للتطبيقات البيولوجية الخلية، استزراع الخلايا الجذعية الدهنية لمدة 3 أيام، وأنتجت بنجاح الماغنيسيوم استخدام برنامجنا ميكروويل. وبالإضافة إلى ذلك، نحن إجراء محاكاة ماجنيتوستاتيك للتحقيق في هذه الآلية، حيث استخدمت القوة المغناطيسية لفخ الخرز الصلب من خلال الثقوب. ونحن نعتقد أنه يمكن تطبيق طريقة تصنيع ميكروويل المقترحة للعديد من الدراسات الخلوية على أساس كروي مثل فحص المخدرات وتجديد الأنسجة، وتمايز الخلايا الجذعية وسرطان خبيث.
Introduction
الخلايا التي نمت في شكل كروي أكثر مشابهة للنسيج الحقيقي في الجسم من ثقافة المستوية ثنائية الأبعاد1. ونظرا لهذه الميزة، قد اعتمدت استخدام الماغنيسيوم لتحسين دراسة تفاعل الخلية للخلية2،3، التنشيط المناعي4، المخدرات الفحص5و6من التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت مؤخرا إلى أورجانويدس (قرب الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة)، والتي مفيدة جداً لدراسة التنمية والأمراض البشرية7الماغنيسيوم دمج أنواع متعددة من الخلايا. وقد استخدمت عدة أساليب لإنتاج الماغنيسيوم. أبسط طريقة ينطوي على استخدام سطح غير لاصق، بتجميع الخلايا مع بعضها البعض والماغنيسيوم النموذج. ويمكن علاج طبق بيتري مع ألبومين المصل البقري أو بلورونيك F-127 أو بوليمر مسعور (مثل بولي 2-هيدروكسييثل ميثاكريلات) لجعل سطح غير لاصق8، 9. الأسلوب قارورة زر الزيادة والنقصان وسيلة أخرى معروفة لإنتاج كميات كبيرة من الماغنيسيوم10،11. في هذا الأسلوب، تشغل الخلايا في تعليق إثارة للحيلولة دون أن تصبح يعلق على الركازة. بدلاً من ذلك، العائمة الخلايا المجمعة الماغنيسيوم النموذج. كل أسلوب سطحي غير لاصقة وغزل قارورة أسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من الماغنيسيوم. ومع ذلك، فتخضع لقيود بما في ذلك صعوبات في التحكم في حجم كروي، فضلا عن التتبع ورصد كل كروي. كعلاج لهذه المشاكل، وأسلوب الإنتاج كروي آخر، إلا وهي إسقاط معلقة أسلوب يمكن العاملين12. وهذا ينطوي على إيداع قطرات تعليق خلية على الجزء السفلي غطاء صحن الثقافة. وعادة ما تكون من 15 إلى 30 ميليلتر في حجم هذه القطرات وتحتوي على ما يقرب من 300 إلى 3000 الخلايا13. عندما هو مقلوب الغطاء، القطرات تجري في مكان التوتر السطحي. ويركز بيئة الجاذبية الصغرى في كل قطره الخلايا، ثم تشكل الماغنيسيوم واحد في واجهة الهواء السائل حرة. فوائد معلقة أسلوب الإسقاط أن يوفر توزيع المساحة التي تسيطر عليها جيدا، في حين أنه من السهل تتبع ورصد كل كروي، مقارنة بالأساليب قارورة المياه السطحية وغزل غير لاصقة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتكبد عيب واحد في هذا الإنتاج الضخمة من الماغنيسيوم وعملية الإنتاج ذاتها مفرطة من حزب العمل المكثف.
مجموعة ميكروويل من شقة لوحة مع العديد من الآبار الصغيرة الحجم، وكل منها يبلغ قطرها يتراوح من 100 إلى 1000 ميكرومتر. مبدأ الإنتاج كروي عند استخدام ميكروويلس شبيه بطريقة سطحية غير لاصقة. وتشمل فوائد حقيقة أن توفر ميكروويلس المسافات بين ميكروويلس لفصل الخلايا أو الماغنيسيوم، مثل أن يكون من السهل التحكم في حجم كروي، حين أيضا يجعل من السهل لرصد كل واحد كروي. مع عدد كبير من ميكروويلس، من الممكن أيضا إنتاج كروي الفائق. ميزة أخرى من ميكروويلس هو الخيار لآبار شكل من أشكال مختلفة (مسدس الأضلاع، أسطواني، البزموت المنشورية) تبعاً لأغراض تجريبية فريدة من نوعها المستخدمين. عموما، إلا أن شكل ثلاثي الأبعاد (3D) مقعرة (أو نصف كروية) تعتبر الأكثر مناسبة لإنتاج الماغنيسيوم واحدة موحدة الحجم. ولذلك، فائدة ميكروويلس مقعرة أبلغ العديد من دراسات البيولوجيا الخلية مثل تلك دراسة كارديوميوسيتي التفريق بين14من الخلايا الجذعية الجنينية، إفراز الأنسولين من خلية جزيرة مجموعات15، النشاط الأنزيمي من خلايا الكبد16، ومقاومة المخدرات الورم الماغنيسيوم17.
ولسوء الحظ، تلفيق ميكروويلس غالباً ما يتطلب وجود مرافق ميكروباتيرنينج المتخصصة؛ الأساليب التقليدية المستندة إلى الطباعة التصويرية تتطلب التعرض، وإنشاء مرافق بينما رد الفعل الأساليب المستندة إلى النقش بايون بحاجة إلى معدات البلازما وأيون-شعاع. هذه المعدات مكلفة، جنبا إلى جنب مع عملية تصنيع معقدة، يعرض حاجز عال لدخول لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى ميكروتيتشنولوجي. للتغلب على هذه المشاكل، طرق أخرى فعالة من حيث التكلفة مثل الجليد الطباعة الحجرية18 (باستخدام قطرات الماء المجمدة) وقد اقترحت طريقة غشاء مرن14 (باستخدام غشاء والركيزة من خلال ثقب وفراغ). ومع ذلك، تحمل هذه الأساليب أيضا عيوب خطيرة مثل كونها صعبة التحكم في أحجام نمط وتحقيق نسب عالية وإنتاج ميكروويلس مساحة أكبر.
للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه، نقترح أسلوب اختﻻق رواية ميكروويل مقعرة استخدام ركيزة من خلال ثقب وخرز الصلب ومجموعة مغناطيس. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن اختﻻق مئات ميكروويلس كروية مقعرة بالاستفادة من إليه الخرز المعدني التأمين الذاتي ساعدت القوة المغناطيسية (الشكل 1). عملية تصنيع ينطوي على استخدام مرافق قليلة جداً معقدة ومكلفة ولا تتطلب الكثير من المهارات المتقدمة. على هذا النحو، يمكن بسهولة إجراء الأشخاص المهرة حتى هذا الأسلوب تلفيق. وللتدليل على الطريقة المقترحة، كانت مثقف الإنسان الدهنية-المستمدة من الخلايا الجذعية في ميكروويلس مقعرة لإنتاج الماغنيسيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان التحدي الرئيسي الذي يواجه هذا الأسلوب تلفيق تحديد آمنة من الخرز في الصفيف من خلال ثقب في لوحة الألومنيوم. لحل هذا التحدي، استخدمت القوة المغناطيسية في شكل مصفوفة المغناطيس 30 × 30 لإصلاح الخرز بشكل أمن، كما هو مبين في أرقام 6 و 7. كثافة التدفق المغناطيسي في الصفيف المغن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث “برنامج بحوث العلوم الأساسية” عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل (2014R1A1A2057527 جبهة الخلاص الوطني وجبهة الخلاص الوطني-2016R1D1A1B03934418).
Materials
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. . Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
