Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için
Summary
Bu el yazması karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı, sağlam bir yöntem sunar. Manyetik kuvvet, çelik boncuk ve bir delik aracılığıyla dizi kullanarak, birkaç yüz microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat kuruldu.
Abstract
Bir küresel kültür bir in vivosağlar hücresel davranış anlamak için yararlı bir araçtır-üç boyutlu ortamda gibi. Yapışkan olmayan yüzeyleri, değer değiştirici şişeler, asılı damla ve microwells hücre hücre etkileşim, bağışıklık-harekete geçirmek, eleme, uyuşturucu çalışmalarda kullanılan gibi çeşitli küresel üretim yöntemleri kök hücre farklılaşması ve organoid üretimi. Bu yöntemler arasında microwells üç boyutlu bir içbükey geometri ile bilim adamları ve mühendisleri üniforma ölçekli küresel üretimi ve hangi ile bireysel pulcuklarının yanıt olabilir kolaylığı kendi avantajları göz önüne alındığında, dikkatini kazanmıştır sınıf başkanı. Esnek membranlar ve litografi buz kullanımı gibi düşük maliyetli yöntemler teklif etmiş olsa bile, bu tekniklerin desen boyutlarını kontrol zorluk başarı yüksek boy oranları ve üretim gibi ciddi sakıncaları uğramak microwells daha geniş alanları. Bu sorunların üstesinden gelmek için karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı için sağlam bir yöntem öneriyorum. Bu yöntem bir 30 x 30 delik aracılığıyla dizi, birkaç yüz mikrometre-sipariş çelik kullanır boncuk ve Manyetik kuvvet 900 microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat olarak imal etmek. Hücre biyolojik uygulamalar için bizim yöntem uygulanabilirliği göstermek için biz yağ kök hücreleri 3 gün boyunca kültürlü ve başarıyla pulcuklarının bizim microwell platformu kullanarak üretti. Buna ek olarak, biz bir tertibatla simülasyon sayede Manyetik kuvvet yoluyla deliklere çelik boncuk tuzağa düşürmek için kullanılan mekanizma, araştırmak için gerçekleştirilen. Biz uyuşturucu tarama, doku yenilenmesi, kök hücre farklılaşma ve kanser metastaz gibi birçok küresel tabanlı hücresel çalışma için önerilen microwell imalat yöntemi uygulanan olabilir inanıyoruz.
Introduction
Küresel forma yetiştirilen hücrelerin bir iki boyutlu düzlemsel kültür1‘ den daha gerçek vücut dokularında benzer. Bu avantaj göz önüne alındığında, pulcuklarının kullanımı çalışma hücre-hücre etkileşim2,3, bağışıklık-harekete geçirmek4,5ve farklılaşma6eleme ilaç geliştirmek için kabul edilmiştir. Ayrıca, birden çok hücre tipleri birleşmeyle pulcuklarının son zamanlarda insan geliştirme ve hastalık7eğitim için çok yararlı olan organoids (yakın-fizyolojik üç boyutlu (3D) doku) uygulanmış olan. Pulcuklarının üretmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Öyle ki birbirimizi ve form pulcuklarının hücreleri toplamak en basit yöntem bir yapışkan olmayan yüzey kullanımını içerir. Petri kabına sığır serum albümin, pluronic F-127 veya onun yüzey yapıştırıcı89yapmak bir hidrofobik polimer (örneğin Poli 2-hydroxyethl metakrilat) ile tedavi edilebilir. Değer değişimi-flask yöntemi pulcuklarının10,11büyük miktarda üreten başka bir iyi bilinen yoludur. Bu yöntemde, hücre süspansiyon onları belgili tanımlık substrate bağlı olma önlemek için karıştırma tarafından tutulur. Bunun yerine, kayan toplamak için form pulcuklarının hücreleri. Yapışkan olmayan yüzey yöntemi ve spinner şişesi yöntemi pulcuklarının büyük miktarda üretebilir. Ancak, küresel boyutu yanı sıra izleme kontrol ve her küresel izleme zorlukları da dahil olmak üzere sınırlamalara tabi bunlar. Böyle bir sorun, başka bir küresel üretim yöntemi, için bir ilaç olarak yani, asılı bırak yöntemi istihdam12olabilir. Bu hücre süspansiyon damla kültür çanak kapağı alt üzerine yatırma içerir. Bu damlalar genellikle 15 ila 30 µL boyutunda ve yaklaşık 300-3000 hücreleri13içerir. Kapağı ters zaman damla yüzey gerilimi tarafından yerinde tutulur. Mikrogravite ortamı içinde her damla tek pulcuklarının ücretsiz sıvı-hava arabirim oluşturan hücreler, yoğunlaşmaktadır. İdam faydaları bırakma yöntem vardır izlemek ve her küresel olmayan yapışkan yüzeyi ve spinner şişesi yöntemleri göre izlemek kolay iken iyi kontrollü boyutu dağıtım sunar. Büyük üretim pulcuklarının ve üretim süreci aşırı emek olmasıdır Ancak, bu yöntem bir dezavantaj maruz kalırsa yoğun.
Bir düz microwell dizidir plaka birçok mikro büyüklükteki wells ile her 100 1000 µm arasında değişen bir çapa sahip. Microwells kullanırken küresel üretim ilkesi olmayan yapışkan yüzey yöntemi için benzer. Microwells öyle ki bu da her tek küresel izlemek kolaylaştırırken küresel boyutunu kontrol etmek kolaydır hücreleri veya pulcuklarının, ayırmak için microwells arasında boşluk sağlamak gerçek yararları. Microwells büyük bir sayı ile yüksek üretilen iş küresel üretim de mümkündür. Form wells seçeneğine farklı şekiller microwells başka bir avantajdır (lokma somun, silindirik, trigonal Prizmatik) bağlı olarak kullanıcıların benzersiz deneysel amaçlar. Genellikle, ancak, üç boyutlu (3D) içbükey (veya hemisferik) şekli tek pulcuklarının üniforma ölçekli üretim için en uygun olarak kabul edilir. Bu nedenle, içbükey microwells kullanışlılığı bu embriyonik kök hücre14, cardiomyocyte farklılaşma incelenmesi gibi birçok hücre biyolojisi Etütler adacık hücre insülin salgılanmasını kümeleri15, bildirilmiştir enzimatik aktivite tetkikine16ve ilaç direnci tümör pulcuklarının17.
Ne yazık ki, sık sık microwells imalatı özel micropatterning İmkanları gerektirir; Plazma ve iyon-kiriş ekipmanları reaktif iyon-gravür tabanlı yöntemleri gerekir klasik fotolitografi tabanlı yöntemler maruz kalma ve gelişmekte olan özellikleri gerektirir. Bu tür ekipman hangi, karmaşık üretim süreci ile birlikte mikroteknoloji erişimi değil biyologlar için giriş yüksek bir engel sunar maliyetlidir. Bu sorunların üstesinden gelmek için düşük maliyetli diğer yöntemler gibi (donmuş su damlacıkları kullanarak) litografi18 buz ve (bir membran, delik aracılığıyla substrat ve bir vakum kullanarak) esnek zar yöntemi14 önerdi. Ancak, bu yöntemler de desen boyutları, yüksek boy oranları kazanma ve daha büyük alan microwells üretimini denetlemek zor olduğu gibi ciddi sakıncaları uğramak.
Yukarıdaki sorunları aşmak için bir delik aracılığıyla substrat, çelik boncuk ve bir mıknatıs dizi roman içbükey microwell imalat yöntemi önerilmektedir. Bu yöntemi kullanarak, içbükey küresel microwells yüzlerce Manyetik kuvvet yoluyla kendi kendine kilitlenen metalik boncuk (şekil 1) mekanizmasının yararlanarak fabrikasyon. İmalat süreci çok az pahalı ve karmaşık özellikleri kullanımını gerektirir ve birçok gelişmiş beceriler talep etmez. Bu nedenle, hatta vasıfsız kişilerin kolayca bu imalat yöntemi üstlenebilir. Önerilen yöntem göstermek için insan yağ elde edilen kök hücre pulcuklarının üretmek için içbükey microwells içinde kültürlü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu imalat yöntemi önündeki büyük sorunu alüminyum plaka delik aracılığıyla dizideki boncuk güvenli sabitleme yapıldı. Bu sorunu çözmek için manyetik kuvvet 30 x 30 mıknatıs dizi şeklinde boncuklar güvenli, rakamlar 6 ve 7gösterildiği gibi düzeltmek için kullanıldı. Manyetik akı yoğunluğu Ters polarite vardır, mıknatıs dizinin her mıknatıs yüzey merkezinde en güçlü olduğu. Manyetik kuvvet gücünü akı yoğunluğu üzerinde bağlıdır çünkü bonc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve Gelecek Planlama (NMK-2014R1A1A2057527 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1D1A1B03934418) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. . Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
