Um grânulo emparelhado e matriz de ímã para moldagem micropoços com geometrias côncavas variáveis

Summary

Este manuscrito introduz um método robusto de fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Usando a força magnética, esferas de aço e uma matriz do através de-furo, várias centenas de micropoços formaram-se em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm.

Abstract

Uma cultura de esferoide é uma ferramenta útil para compreender o comportamento celular em que proporciona um na vivo-como ambiente tridimensional. Vários métodos de produção de esferoide como superfícies não adesivas, frascos de girador, gotas de suspensão e micropoços têm sido utilizados em estudos de interação célula a célula, ativação imune, drogas, triagem, haste diferenciação celular e geração de organoides. Entre esses métodos, os poços da microplaca com uma geometria tridimensional côncavo ganhou a atenção de cientistas e engenheiros, dados suas vantagens de geração de esferoide de tamanho uniforme e a facilidade com que as respostas de esferoides individuais podem ser monitorado. Apesar de cost-effective métodos tais como o uso de membranas flexíveis e litografia de gelo têm sido propostos, estas técnicas incorrer em graves inconvenientes tais como dificuldade em controlar os tamanhos padrão, realização de altas proporções e produção de áreas maiores de micropoços. Para superar estes problemas, propomos um método robusto para fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Este método utiliza uma matriz de através de-furo 30×30, aço de cem micrômetro-ordem vários grânulos e a força magnética para fabricar 900 micropoços em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm. Para demonstrar a aplicabilidade do nosso método para aplicações biológicas de células, nós cultivadas as células-tronco adiposas por 3 dias e produzido com sucesso usando a nossa plataforma de microplacas de esferoides. Além disso, realizamos uma simulação magnetostatic para investigar o mecanismo, pelo qual força magnética foi usada para aprisionar os grânulos aço os através de buracos. Acreditamos que o método de fabricação de microplacas proposto poderia ser aplicado para muitos estudos baseados em esferoide celulares como triagem de drogas, regeneração de tecidos, diferenciação de células-tronco e metástases.

Introduction

As células cultivadas em forma de esferoide são mais semelhantes ao tecido real no corpo que uma cultura planar bidimensional¹. Dada esta vantagem, o uso de esferoides tem sido adotado para melhorar o estudo da interação de célula para célula^2,3, ativação imune⁴,⁵e de diferenciação⁶de despistagem de drogas. Além disso, incorporando vários tipos de células de esferoides recentemente foram aplicados ao organoids (perto de-fisiológicos tridimensional (3D) tecido), que são muito úteis para o estudo de desenvolvimento e doença humana⁷. Vários métodos têm sido utilizados para produzir esferoides. O método mais simples envolve a utilização de uma superfície não-adesivas, tais que as células agregam-se com os outros e esferoides de formulário. Um prato de Petri pode ser tratada com albumina de soro bovino, pluronic F-127 ou um polímero hidrofóbico (por exemplo, metacrilato de 2-hydroxyethl de poli) tornar-se sua superfície não adesivas,⁸⁹. O método de girador-balão é outro meio conhecido de produzir grandes quantidades de esferoides^10,11. Neste método, as células são mantidas em suspensão por mexendo para impedi-los de tornar-se ligado ao substrato. Em vez disso, o flutuante células agregado de esferoides de formulário. O método de superfície não-adesivas e o girador balão método podem produzir grandes quantidades de esferoides. No entanto, eles estão sujeitos a limitações, incluindo dificuldades em controlar o tamanho de esferoide, bem como o acompanhamento e monitoramento de cada esferoide. Como um remédio para esses problemas, um outro método de produção de esferoide, ou seja, a suspensão drop método pode ser empregado¹². Isto envolve depositando gotas de suspensão de células na parte inferior da tampa de um prato de cultura. Estas gotas são geralmente 15 a 30 µ l de tamanho e contêm cerca de 300 a 3000 células¹³. Quando a tampa é invertida, as gotas são mantidas no lugar pela tensão superficial. O ambiente de microgravidade em cada gota concentra as células, que então formam esferoides único em uma interface líquido-ar livre. Os benefícios do enforcamento método drop são que oferece uma distribuição de tamanho bem controlados, enquanto é fácil de rastrear e monitorar cada esferoide, em relação os métodos de balão de superfície e spinner não adesivas. No entanto, esse método incorre em uma desvantagem em que a produção em massa de esferoides e o próprio processo de produção é excessivamente do trabalho intensivo.

Uma matriz de microplacas é um flat placa com muitos poços de tamanho micro, cada um com um diâmetro que varia de 100 a 1000 µm. O princípio de produção de esferoide quando usando micropoços é semelhante do método de superfície não-adesivas. Os benefícios incluem o fato de que os poços da microplaca fornecem espaços entre os poços da microplaca para separar as células ou esferoides, tal que é fácil de controlar o tamanho de esferoide, enquanto também facilitando a monitorar cada único esferoide. Com um grande número de poços da microplaca, produção de alto rendimento esferoide também é possível. Outra vantagem do micropoços é a opção para poços de formulário de diferentes formas (hexahedral, cilíndrico, trigonal prismáticos) dependendo fins experimentais originais dos usuários. Geralmente, no entanto, uma forma tridimensional (3D) côncava (ou hemisférica) é considerada como sendo o mais adequado para a produção de esferoides único tamanho uniforme. Portanto, a utilidade de micropoços côncavos tem sido relatada para muitos estudos de biologia celular tais como aqueles examinando a casos de diferenciação de células-tronco embrionárias¹⁴, a secreção de insulina das células da ilhota clusters de¹⁵, o atividade enzimática de hepatócitos¹⁶e a resistência de droga de tumor esferoides¹⁷.

Infelizmente, a fabricação de micropoços frequentemente requer instalações especializadas micropatterning; métodos baseados em fotolitos convencionais requerem exposição e instalações em desenvolvimento enquanto métodos reativos baseados em íon-gravura precisam de equipamento de plasma e de feixes de iões. Esse equipamento é caro, que, juntamente com o processo de fabricação complicada, apresenta uma alta barreira à entrada para os biólogos que não têm acesso a microtecnologia. Para superar estes problemas, outros métodos de baixo custo tais como gelo litografia¹⁸ (usando as gotas de água congelada) e o método de membrana flexível¹⁴ (usando uma membrana, substrato do através de-furo e vácuo) têm sido sugeridos. No entanto, esses métodos também incorrer em graves inconvenientes tais como sendo difícil controlar os tamanhos padrão, a obtenção de elevadas proporções e a produção dos poços da microplaca área maior.

Para superar as questões acima, propomos um método de fabricação do romance de microplacas côncavo utilizando um substrato do através de-furo, esferas de aço e uma matriz de ímã. Usando esse método, centenas de micropoços esféricos côncavos podem ser fabricadas, aproveitando o mecanismo de força magnética-assistida de travamento automático grânulos metálicos (Figura 1). O processo de fabricação envolve o uso de muito poucas facilidades caros e complicados e não exige muitas habilidades avançadas. Como tal, pessoas mesmo não qualificadas podem facilmente realizar este método de fabricação. Para demonstrar o método proposto, humanos adiposo-derivado de células-tronco foram cultivadas aos micropoços côncavos para produzir esferoides.

Protocol

1. preparação do através de-furo alumínio placa e ímã matriz Preparar duas 50 mm x 50 mm (ou mais) placas de alumínio. A espessura de cada placa foi 300 µm que é metade do diâmetro do grânulo. Forma uma matriz do através de-furo de 30 x 30 em uma das placas de alumínio usando um gravador giratório do CNC com uma Φ550-µm micro broca com 30 mm/s de taxa de mergulho e 8000 RPM de velocidade do eixo. A distância entre cada buraco (centro) foi de 1 mm (Figura 1a</stron…

Representative Results

Um molde convexo e padrão de microplacas com êxito foram fabricadas seguindo as etapas 2.1 a 3.7. (Figura 4). As esferas de aço comerciais ficaram presos na matriz do através de-furo de 30 x 30. Os grânulos realizaram-se, firmemente, sem quaisquer lacunas entre os grânulos e os correspondentes através de furos (figura 4a). A forma de fabricados de microplacas côncava é côncavo hemisférica, com um diâmetro de 600 µm, …

Discussion

O grande desafio deste método de fabricação foi a fixação segura dos grânulos da matriz do através de-furo na placa de alumínio. Para resolver este desafio, força magnética sob a forma de uma matriz de 30 x 30 imã foi usada para corrigir os grânulos firmemente, como mostrado nas figuras 6 e 7. A densidade do fluxo magnético da matriz de ímã, que tem a polaridade oposta, é mais forte no centro de cada superfície do ímã. Porque a força da força magnética depende da de…

Materials

CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011