Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Summary

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Abstract

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell'immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato "immunitario nutrizionale". S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l'espressione, l'arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L'utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un'attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L'attività antimicrobica è basata sull'attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

Introduction

Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni ¹ . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari ^{2 , 3} . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari ^{4 , 5} . All'interno della cellula, il legame Ca ²⁺ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina ⁶ . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell'ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni ⁷ . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l'interazione con i recettori di riconoscimento del pattern ^{8 , 9} . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale ^{10 , 11} .

S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie ^{12 , 13} . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell'interfaccia dimerica ^{14 , 15} . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l'attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria ¹⁸ .

H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti ¹⁹ . L'infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l'infezione da H. pylori .

H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica ^{20 , 21 , 22 , 23} . L' infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell'infezione ^{18 , 24 , 25} . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l'effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l'utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici.

Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l'apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell'ospite ²⁷ . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all'interfaccia dimerica ³¹ . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn ²⁺ , Mn ²⁺ o Fe ²⁺ e il sito 2 può Lega Zn ^{2+ 31 , 32} . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all'attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 ^{, 29} .

Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all'interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = "xref"> 25 ^{, 33} . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l'attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale ²⁵ . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare ³⁴ . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l'ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l'infezione e successiva infiammazione ^{25 , 35} .

Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l'attività legante del metallo della proteina ³⁶ . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l'ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori .

Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l'attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l'aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l'attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori ¹⁸ . Insieme, questi risultati confermano l'importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l'immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell'attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell'host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell'infezione da H. pylori .

Protocol

1. Espressione di S100A12 Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min. Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s. Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min. Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min s…

Representative Results

S100A12 espressione e purificazione Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Bril…

Discussion

Viene presentato un protocollo efficiente sia per l'espressione che per la purificazione dell'uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l'uso di mezzi autoinduttivi ²⁶ che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta ri…

Materials

S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells	New England Biolabs	C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract	Research Products International	Y20020-250.0
NaCl	Research Products International	S23020-500.0
Tryptone	Research Products International	T60060-250.0
FeCl3	Sigma-Aldrich	F2877
MgSO4	Research Products International	M65240-100.0
Na2HPO4	Research Products International	S23100-500.0
KH2PO4	Research Products International	P41200-500.0
NH4Cl	Research Products International	A20424-500.0
Na2SO4	Research Products International	S25150-500.0
Glycerol	Research Products International	G22020-1.0
D-glucose	Research Products International	G32040-500.0
lactose	Sigma-Aldrich	L2643
Selection agent
ampicillin	Research Products International	A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System	GE	29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow	GE	17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR	GE	17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE
Tris Base	Research Products International	T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates	Lab Supply Company	BBL221261
Brucella broth	Sigma-Aldrich	B3051
Cholesterol (250X)	Thermo Fisher Scientific	12531018
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	229997