Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12
Summary
Здесь мы представляем метод для выражения и очистки S100A12 (calgranulin C). Мы описываем протокол для измерения его антимикробной активности против патогена человека H. pylori .
Abstract
Calgranulin белки являются важными медиаторами врожденного иммунитета и являются членами класса S100 семейства EF-hand кальцийсвязывающих белков. Некоторые белки S100 обладают способностью связывать переходные металлы с высокой аффинностью и эффективно изолировать их от вторжения микробных патогенов в процесс, который называется «иммунитет к питанию». S100A12 (EN-RAGE) связывает как цинк, так и медь и очень распространен в врожденных иммунных клетках, таких как макрофаги и нейтрофилы. Мы сообщаем об усовершенствованном методе для экспрессии, обогащения и очистки S100A12 в его активной конфигурации связывания металла. Использование этого белка в анализе роста бактерий и жизнеспособности показывает, что S100A12 обладает антимикробной активностью в отношении бактериального патогена Helicobacter pylori . Антимикробная активность основана на цинксвязывающей активности S100A12, которая хелатирует питательный цинк, тем самым истощая H. pylori, которая требует роста цинка и proliferation.
Introduction
Белки S100 представляют собой класс семейств кальцийсвязывающих белков семейства EF с разнообразным набором функций 1 . Они экспрессируются тканевым и клеточно определенным образом и регулируют широкий спектр клеточных функций 2 , 3 . Уникальные для кальцийсвязывающих белков белки S100 обладают как внутриклеточными, так и внеклеточными функциями 4 , 5 . Внутри клетки связывание Ca 2+ вызывает конформационное изменение, которое обнажает гидрофобную поверхность, которая специфически нацелена на белок-связывающие партнеры 6 . Этот внутриклеточный механизм регулирует важные процессы, такие как клеточная пролиферация, дифференцировка и энергетический обмен. Во внеклеточной среде белки S100 проявляют две функции 7 . В одном они действуют как связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP) белки и инициируют провоспалительныеИммунный ответ через взаимодействие с рецепторами распознавания образов 8 , 9 . Кроме того, некоторые члены S100 белкового класса секвестрируют переходные металлы, функцию, которая служит для голодания микробных патогенов в процессе, называемом питательным иммунитетом 10,11 .
S100A12 (также известный как кальгрунулин C и EN-RAGE) высоко экспрессируется в макрофагах и нейтрофилах и идентифицирован как потенциальный биомаркер воспалительных заболеваний 12 , 13 . В дополнение к связыванию кальция в его участках EF-Hand, S100A12 имеет два сайта связывания с высоким сродством переходного металла, расположенные на противоположных концах интерфейса 14 , 15 димера. Каждый сайт связывания состоит из трех остатков гистидина и одного остатка аспарагиновой кислоты и может содержать хелат цинка или меди <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Недавно мы сообщили, что S100A12-зависимое голодание от цинка играет важную роль в регуляции роста Helicobacter pylori и активности провоспалительных факторов вирулентности 18 .
H. pylori поражает желудок примерно у половины человечества; Что делает его одним из самых успешных бактериальных патогенов 19 . Инфекция H. pylori может привести к значительным исходам желудочно-кишечного тракта, включая гастрит, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфому, связанную с слизистой оболочкой (MALT), и инвазивную аденокарциному желудка (рак желудка). Рак желудка является ведущей причиной смертности от рака, связанного с некардиамой в мире, и единственным крупнейшим связанным фактором риска развития рака желудка является инфекция H. pylori .
H. pylori сохраняется в желудочной нише, несмотря на robuЙ иммунной реакции на патоген, что подчеркивает необходимость лучшего понимания иммунных механизмов борьбы с этой бактериальной инфекцией 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- ассоциированное воспаление характеризуется глубокой инфильтрацией полиморфноядерных клеток или нейтрофилов, которые отлагают репертуар антимикробных белков, включая S100A12, в месте заражения 18 , 24 , 25 . Стремясь понять сложный диалог между хозяином и возбудителем, мы стремились усовершенствовать методику очистки S100A12 и использовать ее для изучения антимикробного воздействия, которое она оказывает на этого с медицинской точки зрения патогена. В приведенном ниже протоколе описан усовершенствованный метод очистки S100A12 в его биологически активном состоянии; Способный связывать питательные металлы с высоким аффиниТи и хелатируя их от вторгающихся микроорганизмов. Кроме того, приведенные ниже методы подчеркивают полезность этого белка как критического реагента для изучения механизма, посредством которого врожденные антимикробные молекулы ограничивают рост бактериальных патогенов.
Белок семейства S100A получил признание как важная группа врожденных молекул иммунной системы, которые участвуют в иммунной передаче сигналов, а также в защите хозяина 27 . Наиболее хорошо изученными из них являются кальпротектин (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Кальпротектин представляет собой связанный с нейтрофилом белок, который образует гетеродимер субъединиц S100A8 и S100A9, который связывает переходные металлы на границе димера 31 . Было показано, что кальпротектин обладает двумя местами связывания металлов: участок 1 может связывать Zn 2+ , Mn 2+ или Fe 2+ , а сайт 2 может Связывают Zn 2+ 31 , 32 . Многочисленные сообщения показали, что кальпротектин обладает противомикробной активностью в отношении различных патогенных микроорганизмов, включая Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli и H.pylori , и что ингибирующее действие обусловлено хелатной активностью металлов 25 , 28 , 29 .
Предыдущая работа продемонстрировала, что капротектин проявляет многочисленные активности в отношении H. pylori, включая изменение структуры липида А во внешней мембране, подавление системы секреции cag-типа IV (которая является основным провоспалительным фактором вирулентности в H. pylori ), индуцируя образование биопленки и подавление Рост и жизнеспособность H. pylori в зависимости от дозыClass = "xref"> 25 , 33 . Кроме того, генетические и биохимические анализы показали, что антибактериальная активность кальпротектина против H. pylori в значительной степени обусловлена его способностью связывать питательный цинк 25 . H. pylori нуждается в цинке, как это было определено предыдущими исследованиями, в которых использовалась химически определенная среда, чтобы определить потребности в микроэлементах, чтобы этот патоген мог расти и размножаться 34 . Кроме того, кальпротектин был очень распространен в тканях, зараженных H.pylori , и связан с нейтрофильными инфильтратами, что указывает на то, что хозяин может использовать кальпротектин в качестве антимикробной стратегии при инфицировании и последующем воспалении 25 , 35 .
Недавние данные, полученные в результате несвязанных методов скрининга протеомики, свидетельствуют о том, что в условиях, когда активные формы кислорода многочисленны, calprotecОлово подвергается посттрансляционным модификациям, которые изменяют сайт связывания гексагистидина, тем самым ингибируя металлосвязывающую активность белка 36 . Таким образом, мы предположили, что другие белки семейства S100A в широком репертуаре этих молекул могут потенциально выступать в качестве вспомогательных металл-хелаторов. Мы выбрали S100A12 для дальнейшего исследования, потому что он не был идентифицирован на вышеупомянутом экране для посттрансляционной модификации, он обладает способностью связывать цинк, и он очень распространен в тканях человека, полученных от инфицированных H. pylori индивидуумов.
Наша работа показывает, что S100A12 может ингибировать рост и жизнеспособность H.pylori дозозависимым образом в G27 штамме H.pylori и что антимикробная активность этого белка может быть обращена путем добавления избытка питательного цинка. Эта работа дополняет нашу предыдущую работу, показывающую, что S100A12 проявляет противомикробную активность против PMSS1 и 7.13 штаммов H.pylori , демонстрируя его широкую антибактериальную активность против многочисленных клинических изолятов и лабораторно адаптированных штаммов H.pylori 18 . Вместе эти результаты подтверждают важность S100A12 в качестве механизма для контроля роста и пролиферации бактерий с помощью питательного иммунитета. Будущие исследования этого важного взаимодействия между хозяином и бактерией могут включать в себя использование активности S100A12 для снижения бактериальной нагрузки в тканях организма-хозяина или определения вклада этого белка в иммунную передачу сигналов в контексте инфекции H.pylori .
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен эффективный протокол для экспрессии и очистки человеческого S100A12. Система экспрессии E. coli является наиболее распространенным инструментом, используемым для производства рекомбинантных белков, особенно когда количество мг требуется для биохимических и биофизически…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Департаментом по развитию карьеры при Департамента по делам ветеранов 1IK2BX001701, премией CTSA UL1TR000445 от Национального центра продвижения трансляционных наук, премий Национального научного фонда № 1547757 и 1400969 и гранта NIH GM05551. Его содержание полностью принадлежит авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национального центра продвижения трансляционных наук или Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
