قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو
Summary
غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) ملزمة هي واحدة من الأحداث المبكرة في G- البروتينات مستقبلات (غر) تفعيل. يصف هذا البروتوكول كيفية وصف فارماكولوجيكال التفاعلات غر-يجند محددة عن طريق رصد ربط التناظرية غتب التناظرية، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، في استجابة ل يجند من الفائدة.
Abstract
مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات الغشاء التي تلعب أدوارا حاسمة في علم وظائف الأعضاء الخلوية الطبيعية وتشكل هدفا رئيسيا الدوائية لعدة مؤشرات، بما في ذلك تسكين، وتنظيم ضغط الدم، وعلاج الأمراض النفسية. على يجند ملزمة، غكرز تحفيز تفعيل الخلايا G- البروتينات من خلال تحفيز دمج غوانوزين ثلاثي الفوسفات (غتب). تنشيط البروتينات G ثم تحفيز مسارات الإشارات التي تثير الاستجابات الخلوية. يمكن رصد إشارات غر عن طريق قياس دمج شكل راديولبلد وغير قابل للتحلل من غتب، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، في G- البروتينات. وخلافا للأساليب الأخرى التي تقيم المزيد من عمليات التشوير المصب، [ 35 S] غتبس ملزمة يقيس حدث داني في إشارات غر، والأهم من ذلك، يمكن أن يميز أغونيستيسي، المضادات، و منبهات معكوس. ويوضح هذا البروتوكول طريقة حساسة ومحددة لدراسة إشارات غكر باستخدام الاستعدادات الغشاء الخام من غر نموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1). على الرغم من وجود نهج بديلة لكسر الخلايا والأنسجة موجودة، وكثير منها باهظة التكلفة، مملة، و / أو تتطلب معدات المختبرات غير القياسية. توفر الطريقة الحالية إجراء بسيط يثري الأغشية الخام الوظيفية. بعد عزل MOR1، تم تحديد الخصائص الدوائية المختلفة من ناهض لها، [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو)، ومضاد، نالوكسون.
Introduction
مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات سطح الخلية المسؤولة عن مجموعة ملحوظة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك تسكين، والشم، والسلوك 1 . غرس تعمل عن طريق الاستشعار عن إشارات خارجية محددة وتحفيز في وقت لاحق إشارات الخلايا. وبالتالي فإنها تمثل مفترقا رئيسيا بين البيئات الخارجية والداخلية للخلية. ونظرا للدور الحاسم الذي تلعبه غرس في علم الأحياء، فقد أصبحت أهدافا رئيسية لكل من البحث الأساسي واكتشاف العقاقير 2 ، 3 .
وخلافا لأسر المستقبلات الأخرى التي تربط بروابط منفصلة، غرس يمكن ربط أنواع مختلفة جدا من الجزيئات. في حين أن واحد غر قد تتفاعل مع الببتيدات، وآخر قد يشعر الفوتونات، جزيئات صغيرة، أو الأيونات 1 ، 4 . في حين أن بروابطها متنوعة، غرس موحدة في معماريتها العامةأور وظيفة. تتكون غرس الفردية تتكون من سبعة البروتينات α حلزونية الغشاء مع المحطات الأمينية خارج الخلية ومحطات الكربوكسيل داخل الخلايا 5 ، 6 . يقترن غرس إلى البروتينات G- البروتينات-هيتيروتريمريك المجمعات البروتين تتألف من α، β، و γ الوحدات الفرعية التي تتوسط مسارات الإشارات المختلفة 7 . الوحدة الفرعية G α هو بروتين ملزم من النيوكليوتيدات غوانين وهو غير نشط عندما تكون ملزمة لغوسين ثنائي الفوسفات (غب) ونشطة عندما تكون ملزمة ل غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) 8 ، 9 . عندما ترتبط غكرز بروابطها، فإنها تخضع لتغيير تراكمي يسمح G α للفصل من G βγ ، مما يسمح G α لتبادل الناتج المحلي الإجمالي ل غتب 7 . فوسفهوريلاتد نفسها في محطة الكربوكسيل من قبل مختلف سيرين / ثريونفي كيناز 10 ، 11 واستيعابها لتخفيف إشارات مستقبلات 12 ، 13 ، 14 . وفي الوقت نفسه، يتم تنشيط المونومر G α و G βγ ديمر لتنشيط مسارات الإشارات المميزة 7 . هناك العديد من الأشكال الإسوية لكل وحدة فرعية من البروتينات G، ويهدف كل شكل إسوي مسارات معينة في اتجاه المصب ونظم رسول ثانوية. وتشمل الأشكال الشكلية G α الرئيسية G s و G q و G i / o و G 12-13 . عادة، غرس الفردية المرتبطة مع إيسوفورم G α معينة ، وبالتالي ربط حافز خارجي لاستجابة الخلوية محددة 1 .
توصيف التفاعل غر-يجند أمر بالغ الأهمية لفهم البيولوجيا للمستقبلات. كما الناتج المحلي الإجمالي / تبادل غتب هو واحد من عشية أقربنتس يلي يجند ملزمة، ورصد غتب ملزمة يمكن قياس تنشيط غر أو تثبيط. إن فحص المزيد من أحداث المصب في إشارات غكر غالبا ما لا يكون كمي أو متكافئ، قد لا يميز منبهات كاملة من تلك الجزئية، ويمكن أن يتطلب الكواشف باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، زيادة غتب ملزمة للبروتينات G α هو حدث شبه عالمي بعد تفعيل غر، وهذا يعني أن قياس غتب ملزمة هو مقايسة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لرصد نشاط معظم غرس. قياس غتب ملزمة هو نهج بسيط وسريع لرصد الإشارات غر في الخلايا أوفيركسريسينغ مستقبلات من الفائدة أو في الأنسجة المحلية. هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة ملزمة غتب وظيفية باستخدام غر النموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1)، لتحديد كميا نشاط ناهض ومضاد على إشارات غر.
يوضح هذا البروتوكول أولا كيفية عزل الأغشية الخام من الخلايا أوفيركسريسينغ MOR1. ملاحظة ثار هذا البروتوكول لا يقتصر على أنظمة أوفيركسريسيون ويمكن تطبيقها على العديد من مصادر الغشاء، بما في ذلك الأنسجة الأصلية أو الاستعدادات معربا عن مستقبلات متعددة والبروتينات G 15 . بروتوكول ثم تفاصيل كيفية قياس ملزم غتب التناظرية إلى هذه الأغشية ردا على تركيزات مختلفة من [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو) أو نالوكسون، ناهض MOR1 ومضاد، على التوالي. و غتب التناظرية، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، غير قابلة للتحلل. هذه الخاصية أمر بالغ الأهمية لأن G α الوحدات الفرعية تظهر النشاط غتباس جوهري 7 ، والقضاء على فوسفات غاما المسمى على مادة كيميائية غتب هدروليزابل. ثم يتم حبس الأغشية على مرشحات الألياف الزجاجية وغسلها، وبعد ذلك يتم تحديد غتب راديولبلد بواسطة العد التلألؤ السائل. يمكن اشتقاق المعلمات الدوائية متعددة إلى تشاراكتريزه التفاعل المستقبلي-يجند، بما في ذلك الاستجابة نصف القصوى (إيك 50 ) ومعامل هيل (ن H ) للالمضادات والتركيز مثبط نصف القصوى (إيك 50 ) والتوازن التفكك ثابت (K ب ) للمضادات 16 و 17 ، 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقتين منفصلتين ولكن تكميليتين: نهج بسيط لتجزئة الخلايا والأنسجة إلى مقصورات واسعة ولكنها متميزة ووسيلة للتحقيق في إشارات غر عن طريق قياس [ 35 S] غتبس ملزمة.
تجزئة الخلوية فعالة لديها مجموعة واسعة من التط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة دا-000266 وبرنامج التدريب الطبي T32 منحة الطبيب (كف، نوز، وأجهزة الكمبيوتر). ويود المؤلفون أيضا أن يعترفوا شققا 18: 24 (somersault1824.com) لمكتبة العلوم والطبية الرسوم التوضيحية.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
