Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Summary

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ ³⁵ S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Abstract

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Transmembran-Rezeptoren, die in der normalen zellulären Physiologie kritische Rollen spielen und ein großes pharmakologisches Ziel für multiple Indikationen darstellen, einschließlich Analgesie, Blutdruckregulation und Behandlung psychiatrischer Erkrankungen. Nach der Ligandenbindung katalysieren GPCRs die Aktivierung von intrazellulären G-Proteinen durch Stimulierung des Einbaues von Guanosintriphosphat (GTP). Aktivierte G-Proteine ​​stimulieren dann Signalwege, die zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die GPCR-Signalisierung kann durch Messung des Einbringens einer radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren Form von GTP, [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ ³⁵ S] GTPγS) in G-Proteine ​​überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die mehr nachgeschaltete Signalisierungsprozesse beurteilen, misst [ ³⁵ S] GTPγS-Bindung ein proximales Ereignis in der GPCR-Signalisierung und kann vor allem Agonis unterscheidenTs, antagonisten und inverse agonisten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine empfindliche und spezifische Methode zum Studieren der GPCR-Signalisierung unter Verwendung von Rohmembranpräparationen eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1). Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben existieren, sind viele kostenaufwendig, langwierig und / oder erfordern nicht standardisierte Laborgeräte. Die vorliegende Methode liefert ein einfaches Verfahren, das funktionelle Rohmembranen angereichert. Nach der Isolierung von MOR1 wurden verschiedene pharmakologische Eigenschaften seines Agonisten, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) und Antagonist, Naloxon, bestimmt.

Introduction

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die für eine bemerkenswerte Reihe von physiologischen Prozessen verantwortlich sind, einschließlich Analgesie, Olfusion und Verhalten ¹ . GPCRs wirken, indem sie spezifische externe Signale erfassen und anschließend die intrazelluläre Signalisierung stimulieren. Sie markieren daher eine Schlüsselverbindung zwischen den äußeren und inneren Umgebungen einer Zelle. Aufgrund der kritischen Rolle, die GPCRs in der Biologie spielen, sind sie zu Hauptzielen für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung geworden ^{2 , 3} .

Im Gegensatz zu anderen Rezeptorfamilien, die diskrete Liganden binden, können GPCRs sehr unterschiedliche Molekülarten binden. Während ein GPCR mit Peptiden interagieren kann, kann ein anderer Photonen, kleine Moleküle oder Ionen ^{1 , 4} feststellen. Während ihre Liganden vielfältig sind, sind GPCRs in ihrem Gesamtarchitekten vereintUnd Funktion. Individuelle GPCRs bestehen aus sieben α-helicalen Transmembranproteinen mit extrazellulären Aminoterminals und intrazellulären Carboxylterminals ^{5 , 6} . GPCRs sind an intrazelluläre G-Proteine-heterotrimere Proteinkomplexe aus α-, β- und γ-Untereinheiten gekoppelt, die verschiedene Signalwege vermitteln ⁷ . Die G _{& agr} ; -Untereinheit ist ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, das inaktiv ist, wenn es an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden ist und aktiv ist, wenn es an Guanosintriphosphat (GTP) ^{8 , 9} gebunden ist. Wenn GPCRs ihre Liganden binden, unterliegen sie einer Konformationsänderung, die es ermöglicht, dass G _{& agr;} von G _{& bgr; &} ggr _{; abtrennt} , wodurch G _{& agr;} das GDP für GTP ⁷ _austauschen kann. Der Rezeptor selbst wird an seinem Carboxylterminal durch verschiedene Serin / Threon phosphoryliertIne-Kinasen ^{10 , 11} und verinnerlicht, um die Rezeptorsignalisierung ^{12 , 13 , 14} zu dämpfen. Mittlerweile verlaufen das aktivierte G _{& agr;} -Monomer und das G _{& bgr; &} ggr _{; -Dimer} , um unterschiedliche Signalwege ⁷ zu aktivieren. Es gibt mehrere Isoformen jeder G-Protein-Untereinheit, und jede Isoform zielt auf bestimmte nachgeschaltete Wege und sekundäre Messenger-Systeme ab. Die Haupt-G _{& agr;} -Isoformen umfassen G _s , G _q , G _{i / o} und G _12-13 . Typischerweise assoziieren einzelne GPCRs mit einer bestimmten G _{& agr;} -Isoform, wodurch ein externer Stimulus mit einer spezifischen zellulären Antwort ¹ verbunden wird.

Die Charakterisierung einer GPCR-Ligand-Interaktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie des Rezeptors. Da der BIP / GTP-Austausch einer der frühesten Vorabend istNts, die der Ligandenbindung folgen, die Überwachung der GTP-Bindung kann die GPCR-Aktivierung oder Hemmung messen. Das Testen von mehr nachgeschalteten Ereignissen in der GPCR-Signalisierung ist oft nicht so quantitativ oder stöchiometrisch, kann nicht vollständige Agonisten von partiellen unterscheiden und kann teure Reagenzien erfordern. Darüber hinaus ist eine erhöhte GTP-Bindung an G _{& agr;} -Proteine ​​ein fast universelles Ereignis nach der GPCR-Aktivierung, was bedeutet, dass die Messung der GTP-Bindung ein weitgehend anwendbarer Assay zur Überwachung der Aktivität der meisten GPCRs ist. Die Messung der GTP-Bindung ist ein einfacher und schneller Ansatz zur Überwachung der GPCR-Signalisierung in Zellen, die den Rezeptor von Interesse oder in nativem Gewebe überexprimieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen funktionellen GTP-Bindungsassay unter Verwendung eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1), um die Aktivität eines Agonisten und Antagonisten auf GPCR-Signalisierung quantitativ zu bestimmen.

Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Rohmembranen aus Zellen, die MOR1 überexprimieren, isoliert. Anmerkung thaDieses Protokoll ist nicht auf Überexpressionssysteme beschränkt und kann auf viele Membranquellen angewendet werden, einschließlich natives Gewebe oder Präparate, die mehrere Rezeptoren und G-Proteine ​​ausdrücken. Das Protokoll beschreibt dann, wie man die Bindung eines radioaktiven GTP-Analogons an diese Membranen in Abhängigkeit von variierenden Konzentrationen von [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -Enkephalin (DAMGO) oder Naloxon, einem MOR1-Agonisten und -Antagonisten, beziehungsweise. Das GTP-Analog-, [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ ³⁵ S] GTPγS) ist nicht hydrolysierbar. Diese Eigenschaft ist kritisch, da G _{& agr;} -Untereinheiten eine intrinsische GTPase-Aktivität ⁷ aufweisen und das markierte Gamma-Phosphat auf einer hydrolysierbaren GTP-Radiochemie eliminieren würden. Membranen werden dann auf Glasfaserfilter gefangen und gewaschen, wonach das radioaktiv markierte GTP durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wird. Mehrere pharmakologische Parameter können zu charakterisiert werdenE die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, einschließlich der halbmaximalen Antwort (EC ₅₀ ) und des Hill-Koeffizienten (n _H ) für Agonisten und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC ₅₀ ) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K _b ) für die Antagonisten ^{16 , 17 , 18}

Protocol

1. Expression von rekombinantem HA-MOR1 in kultivierten Zellen HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen laminaren Strömungshaube. Sterilisieren Sie die Zellkultur-Laminar-Flow-Kapuze mit 70% Ethanol und halten Sie sterile Technik in der gesamten Zellkultur. Bereiten menschliche embryonale Nierenzellen vor 293 (HEK293) Zellkulturmedium, vollständiges Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1%…

Representative Results

Zellfraktionierung kann verwendet werden, um Membran-assoziierte Proteine ​​aus zytosolischen und nuklearen Proteinen zu isolieren und zu bereichern. Abbildung 1 ist ein Western-Blot, der den Inhalt der drei primären Fraktionen demonstriert, die während des subzellulären Fraktionierungsprozesses gesammelt werden können. Speziell zeigt Fig. 1 , daß die Fraktionierung Membranproteine ​​( dh Na + / K + ATPase,…

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei getrennte, aber komplementäre Methoden: einen einfachen Ansatz zur Fraktionierung von Zellen und Geweben in breite, aber unterschiedliche Kompartimente und ein Mittel zur Untersuchung der GPCR-Signalisierung durch Messung der [ ³⁵ S] GTPγS-Bindung.

Die effiziente zelluläre Fraktionierung hat eine breite Palette von Anwendungen, angefangen von der Extraktion und Anreicherung von Proteinen bis hin zur Bewertung der subzellulären Lokalisa…

Materials

DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	10313021	Warm in 37°C water bath before use
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Warm in 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Warm in 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070	Warm in 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Warm in 37°C water bath before use
Cell culture 10-cm plate	Sigma-Aldrich	CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)	Thermo Fisher Scientific	BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	2900
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DO632
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028-1
Pellet pestles motor	Sigma-Aldrich	Z359971
Pestles	Bel Art	F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA)	Affymetrix	10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)	Perkin Elmer	NEG030H
non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)	Sigma-Aldrich	89378
guanosine diphosphate (GDP)	Sigma-Aldrich	51060
Bradford reagent	Bio-Rad	5000006
UV/VIS spectrophotometer	Beckman Coulter	DU640
spectrophotometer cuvettes	USA Scientific	9090-0460
orbital shaker	Thermo Fisher Scientific	2314
thermomixer	Eppendorf	535027903
glass fiber filters	GE Healthcare Life Sciences	1821-021
vacuum filtration apparatus	Millipore Corporation	XX2702550
desktop microcentrifuge	Eppendorf	65717
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
scintillation fluid	Ecoscint A	LS-273
scintillation counter vials	Beckman Coulter	592690
scintillation vial lids	Beckman Coulter	592928
Prism 6	GraphPad Software	PRISM 6
ATP1A1 antibody	Developmental Studies Hybridoma	a6F	1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody	EMD Millipore	CB1001	1:5000 in 3% BSA
H2B antibody	Cell Signaling	2934S	1:2500 in 3% BSA
PDI antibody	Cell Signaling	3501S	1:1000 in 3% BSA
HA antibody	Roche	11867423001	1:2000 in 3% BSA