מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב
Summary
Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.
Abstract
קולטני G-Protein-Coupled (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני טרנסממברנים, הממלאים תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה הסלולרית הרגילה ומהווים יעד פרמקולוגי חשוב לאינדיקציות מרובות, כולל כאבים, ויסות לחץ דם והטיפול במחלות פסיכיאטריות. עם ליגנד מחייב, GPCRs מזרז את ההפעלה של חלבונים G תאיים על ידי גירוי שילוב של trianosphate guanosine (GTP). G- חלבונים מופעלים מכן לעורר נתיבי איתות המעורר תגובות הסלולר. ניתן לפקח על איתות GPCR על-ידי מדידת שילוב של רדיופלאד ולא-הידרוליזה של GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), לתוך חלבונים G. שלא כמו שיטות אחרות המעריכות תהליכי איתות נוספים במורד הזרם, [ 35 S] מחייב GTPγS מודד אירוע פרוקסימלי בסימון GPCR, וחשוב מכך, ניתן להבחין בין agonisטס, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה וספציפית לחקר איתות GPCR תוך שימוש בהכנות ממברנות גולמיות של GPCR ארכיטיפי, הקולטן מסוג אופיואיד (MOR1). למרות גישות חלופיות לתאים ורקמות מופרדים קיימים, רבים הם עלות אוסרני, מייגע, ו / או דורשים ציוד מעבדה לא סטנדרטית. השיטה הנוכחית מספקת הליך פשוט המעשיר קרום גולמי תפקודי. לאחר בידוד MOR1, תכונות פרמקולוגיות שונות של אגוניסט, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -נקפאלין (DAMGO), ואנטגוניסט, naloxone, נקבעו.
Introduction
G-RPRs (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני שטח התא האחראים על מגוון מדהים של תהליכים פיזיולוגיים, כולל שיכוך כאבים, ריפוי והתנהגות 1 . GPCRs לפעול על ידי חישה אותות חיצוניים ספציפיים ולאחר מכן מגרה איתות תאיים. לכן הם מציינים צומת מפתח בין הסביבות החיצוניות והפנימיות של התא. בשל התפקיד הקריטי GPCRs לשחק בביולוגיה, הם הפכו מטרות מרכזיות הן במחקר בסיסי גילוי סמים 2 , 3 .
בניגוד למשפחות קולטן אחרות המחברות ליגנים נפרדים, GPCRs יכול לקשור סוגים שונים מאוד של מולקולות. בעוד אחד GPCR עשוי אינטראקציה עם פפטידים, אחר עשוי לחוש פוטונים, מולקולות קטנות, או יונים 1 , 4 . בעוד ligands שלהם הם מגוונים, GPCRs מאוחדים האדריכל הכולל שלהםUre ו פונקציה. GPCRs בודדים מורכבים של שבעה חלבונים טרנסממברניים α-הסליל עם מסופי אמינו תאיים מסופי carboxyl תאיים 5 , 6 . GPCRs מצמידים אל חלבונים G תאיים-קומפלקסים חלבונים הטרוטרימריים המורכבים α, β, ו γ יחידות משנה, אשר מתווך מסלולים איתות שונים 7 . G α יחידת משנה הוא חלבון נוקליאוטיד גוואנין מחייב כי הוא לא פעיל כאשר קשורה diphosphate guanosine (תוצר) ופעילה כאשר קשורה כדי triphosphate guanosine (GTP) 8 , 9 . כאשר GPCRs לאגד ligands שלהם, הם עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר G α לנתק מ G βγ , ובכך מאפשר G α להחליף התמ"ג עבור GTP 7 . הקולטן עצמו הוא phosphorylated במסוף carboxyl שלה על ידי serine / threon שוניםIne קינאזות 10 , 11 ו מופנם להפחתת קולטן איתות 12 , 13 , 14 . בינתיים, מופעל מונומר G α ו G βγ dimer להמשיך להפעיל נתיבי איתות שונים 7 . ישנם מספר איזופורמים של כל יחידת משנה של חלבונים, וכל איזופורם מכוון למסלולים במורד הזרם ובמערכות שליחים משניות. האיזופורמים העיקריים של G α כוללים G, G q , G / i , ו- G 12-13 . בדרך כלל, GPCRs בודדים מקשרים עם איזופורם G α מסוים , ובכך מקשרים גירוי חיצוני לתגובה תאית ספציפית 1 .
אפיון אינטראקציה GPCR-ligand הוא קריטי להבנת הביולוגיה של הקולטן. כמו התמ"ג / חילופי GTP הוא אחד הראשונים ערבNts כי בעקבות ליגנד מחייב, ניטור GTP מחייב יכול למדוד הפעלה GPCR או עיכוב. Assaying יותר אירועים במורד GPCR איתות הוא לעתים קרובות לא כמותי או stoichiometric, לא יכול להבחין אגוניסטים מלאים מחלקיקים, והוא יכול לדרוש ריאגנטים יקר. יתר על כן, הגדלת GTP מחייב חלבונים G α הוא אירוע כמעט אוניברסלי לאחר ההפעלה GPCR, כלומר מדידה GTP מחייב הוא assay ישים נרחב לניטור הפעילות של GPCRs ביותר. מדידת GTP מחייב היא גישה פשוטה ומהירה לפקח איתות GPCR בתאים overexpressing קולטן של עניין או רקמות הילידים. בפרוטוקול הנוכחי פרטים assay פונקציונלי GTP מחייב באמצעות GPCR ארכיטיפי, קולטן μ אופיואידים (MOR1), כדי לקבוע כמותית את הפעילות של אגוניסט אנטגוניסט על GPCR איתות.
פרוטוקול זה מתאר תחילה כיצד לבודד ממברנות גסות של תאים overexpressing MOR1. הערה thaלא פרוטוקול זה אינו מוגבל מערכות overexpression והוא יכול להיות מיושם על מקורות רבים של הממברנה, כולל רקמה מקומית או תכשירים המבטאים קולטנים מרובים חלבונים G 15 . לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד למדוד את הכריכה של אנלוגי GTP רדיואקטיבי לממברנות אלה בתגובה לריכוזים שונים של [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] – אנקפאלין (DAMGO) או נלוקסון, אגוניסט ואנטגוניסט MOR1, בהתאמה. האנלוגי של ה- GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), הוא לא hydrolyzable. תכונה זו היא קריטית כי G α יחידות משנה התערוכה פעילות GTPase מהותי 7 יבטלו את הפוספט גמא שכותרתו על רדיואקטיבי GTP hydrolyzable. ממברנות נלכדים מכן על גבי מסנני סיבי זכוכית ושטף, לאחר מכן את gTP radiolabeled הוא לכמת על ידי ספירת הנוזל scintillation. הפרמטרים הפרמקולוגיים מרובים ניתן לגזור characterizE אינטראקציה קולטן ליגנד, כולל תגובה חצי מקסימלית (EC 50 ) ואת מקדם היל (n) עבור אגוניסטים ואת ריכוז מעכב מקסימלי חצי (IC 50 ) ו שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (K ב ) עבור אנטגוניסטים 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות נפרדות אך משלימות: גישה פשוטה לתאים ורקמות מפוצלות לתאים רחבים אך ברורים ואמצעי לחקור את אותות GPCR על ידי מדידת [ 35 S] GTPγS מחייב.
חלוקה תאית יעילה יש מגוון רחב של יישומים, החל מיצוי והעשרה של חלב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DA-000266 ואת תוכנית מדען רפואי T32 מענק (קורות חיים, NWZ, ו- PCS). המחברים היו רוצים גם להודות somersault18: 24 (somersault1824.com) עבור הספרייה המדעית & איורים רפואיים.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
