Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding
Summary
Guanosintriphosphat (GTP) -binding er en af de tidligste begivenheder i G-protein-koblet receptor (GPCR) -aktivering. Denne protokol beskriver, hvordan man farmakologisk karakteriserer specifikke GPCR-ligandinteraktioner ved at overvåge bindingen af den radiomærkede GTP-analog, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS), i Svar på en ligand af interesse.
Abstract
G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) er en stor familie af transmembrane receptorer, som spiller kritiske roller i normal cellulær fysiologi og udgør et stort farmakologisk mål for flere indikationer, herunder analgesi, blodtryksregulering og behandling af psykiatrisk sygdom. Ved ligandbinding katalyserer GPCR'er aktiveringen af intracellulære G-proteiner ved at stimulere inkorporering af guanosintrifosfat (GTP). Aktiverede G-proteiner stimulerer derefter signaleringsveje, som fremkalder cellulære responser. GPCR-signalering kan overvåges ved at måle inkorporeringen af en radioaktivt mærket og ikke-hydrolyserbar form af GTP, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS) i G-proteiner. I modsætning til andre metoder, der vurderer flere downstream-signaleringsprocesser, måler [35S] GTPγS-binding en proximal begivenhed i GPCR-signalering og kan vigtigere adskille agonisTs, antagonister og inverse agonister. Den foreliggende protokol beskriver en følsom og specifik metode til undersøgelse af GPCR-signalering ved anvendelse af råmembranpræparater af en arketypisk GPCR, μ-opioidreceptoren (MOR1). Selv om der findes alternative tilgange til fraktionering af celler og væv, er mange kostprisforbudne, kedelige og / eller kræver ikke-standard laboratorieudstyr. Den foreliggende fremgangsmåde tilvejebringer en simpel procedure, der beriger funktionelle råmembraner. Efter isolering af MOR1 blev forskellige farmakologiske egenskaber af dets agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) og antagonist, naloxon, bestemt.
Introduction
G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) er en stor familie af celleoverfladereceptorer, der er ansvarlige for et bemærkelsesværdigt udvalg af fysiologiske processer, herunder analgesi, olfaction og adfærd 1 . GPCR'er virker ved at detektere specifikke eksterne signaler og efterfølgende stimulere intracellulær signalering. De markerer derfor et nøgleforbindelse mellem de eksterne og interne miljøer i en celle. På grund af den afgørende rolle, som GPCR'er spiller i biologi, er de blevet store mål for både grundforskning og narkotikaforskning 2 , 3 .
I modsætning til andre receptorfamilier, der binder diskrete ligander, kan GPCR'er binde meget forskellige typer af molekyler. Mens en GPCR kan interagere med peptider, kan en anden fornemme fotoner, små molekyler eller ioner 1 , 4 . Mens deres ligander er forskellige, er GPCR'er samlet i deres overordnede arkitektUre og funktion. Individuelle GPCR'er består af syv a-spiralformede transmembranproteiner med ekstracellulære aminoterminaler og intracellulære carboxylterminaler 5 , 6 . GPCR'er er koblet til intracellulære G-proteiner-heterotrimeriske proteinkomplekser sammensat af a, p- og y-underenheder, som medierer forskellige signaleringsveje 7 . G a- underenheden er et guaninukleotidbindende protein, der er inaktivt, når det er bundet til guanosindifosfat (BNP) og aktivt, når det bindes til guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . Når GPCR'er binder deres ligander, undergår de en konformationsændring, der tillader G a at dissociere fra G β , hvorved G a kan udveksle BNP for GTP 7 . Receptoren selv er phosphoryleret ved sin carboxylterminal af forskellige serin / threonInin kinaser 10 , 11 og internaliseret til dæmpning af receptorsignalering 12 , 13 , 14 . I mellemtiden fortsætter den aktiverede G a- monomer og G- β- dimer for at aktivere forskellige signaleringsveje 7 . Der er flere isoformer af hver G-protein-underenhed, og hver isoform målretter bestemte nedstrømsveje og sekundære messenger-systemer. De store G a- isoformer indbefatter G s , G q , G i / o og G 12-13 . Typisk associeres individuelle GPCR'er med en bestemt G a- isoform, hvorved der kobles en ekstern stimulus til et specifikt cellulært respons 1 .
Karakterisering af en GPCR-ligandinteraktion er kritisk for forståelsen af receptorens biologi. Som BNP / GTP-udveksling er en af de tidligste aftenerNts, der følger ligandbindende, overvågning af GTP-binding kan måle GPCR-aktivering eller -inhibering. At analysere flere downstream-hændelser i GPCR-signalering er ofte ikke så kvantitativ eller støkiometrisk, må ikke skelne fuld agonister fra partielle, og kan kræve dyre reagenser. Endvidere er øget GTP-binding til G α -proteiner en næsten universel begivenhed efter GPCR-aktivering, hvilket betyder, at måling af GTP-binding er et bredt anvendeligt assay til overvågning af aktiviteten hos de fleste GPCR'er. Måling af GTP-binding er en simpel og hurtig tilgang til overvågning af GPCR-signalering i celler, der overudtrykker receptor af interesse eller i nativt væv. Den foreliggende protokol beskriver et funktionelt GTP-bindingsassay under anvendelse af en arketypisk GPCR, μ-opioidreceptoren (MOR1) for kvantitativt at bestemme aktiviteten af en agonist og antagonist ved GPCR-signalering.
Denne protokol beskriver først hvordan man isolerer råmembraner fra celler, der overudtrykker MOR1. Bemærk thaDenne protokol er ikke begrænset til overekspressionssystemer og kan påføres mange membrankilder, herunder nativt væv eller præparater, som udtrykker flere receptorer og G-proteiner 15 . Protokollen beskriver derefter hvordan man måler bindingen af en radioaktiv GTP-analog til disse membraner som reaktion på varierende koncentrationer af [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) eller naloxon, en MOR1-agonist og antagonist, henholdsvis. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS) er ikke hydrolyserbar. Denne egenskab er kritisk, fordi Ga-underenheder udviser egen GTPaseaktivitet 7 og eliminerer det mærkede gammafosfat på en hydrolyserbar GTP-radiokemisk. Membraner fanges derefter på glasfiberfiltre og vaskes, hvorefter den radioaktivt mærkede GTP kvantificeres ved væskescintillationstælling. Flere farmakologiske parametre kan udledes til karakteriseringE receptor-ligand-interaktionen, herunder halv-maksimal respons ( EC50 ) og Hill-koefficient (nH) for agonister og den halv maksimal inhiberende koncentration (IC50) og ligevægt dissociationskonstant (Kb) for antagonister 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende protokol beskriver to separate, men komplementære metoder: En simpel tilgang til fraktionering af celler og væv i brede, men særskilte rum og et middel til at undersøge GPCR-signalering ved at måle [35S] GTPγS-binding.
Effektiv cellulær fraktionering har en bred vifte af anvendelser, der spænder fra udvinding og berigelse af proteiner til vurdering af subcellulær lokalisering af proteiner til undersøgelse af receptorfarmakologi. Selv om alternative tilgange til fra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant DA-000266 og Medicinsk Videnskabsuddannelsesprogram T32 grant (CV, NWZ, og PCS). Forfatterne vil også gerne anerkende somersault18: 24 (somersault1824.com) for biblioteket for videnskab og medicinske illustrationer.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
