Måling av G-proteinkoblet reseptor-signalering via radiomerket GTP-binding
Summary
Guanosintrifosfat (GTP) binding er en av de tidligste hendelsene i G-protein-koblet reseptor (GPCR) aktivering. Denne protokollen beskriver hvordan man farmakologisk karakteriserer spesifikke GPCR-ligand-interaksjoner ved å overvåke bindingen av den radiomerkede GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-O- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPγS), i Svar på en ligand av interesse.
Abstract
G-proteinkopplede reseptorer ( GPCRs ) er en stor familie av transmembrane reseptorer som spiller kritiske roller i normal cellulær fysiologi og utgjør et stort farmakologisk mål for flere indikasjoner, inkludert analgesi, blodtrykksregulering og behandling av psykiatrisk sykdom. Ved ligandbinding katalyserer GPCRs aktiveringen av intracellulære G-proteiner ved å stimulere inkorporering av guanosintrifosfat (GTP). Aktiverte G-proteiner stimulerer deretter signalveier som fremkaller cellulære responser. GPCR-signalering kan overvåkes ved å måle inkorporeringen av en radiomerket og ikke-hydrolyserbar form av GTP, [35S] guanosin-5'-0- (3-tiotrifosfat) ([35S] GTPγS) i G-proteiner. I motsetning til andre metoder som vurderer flere nedstrøms signalprosesser, måler [35S] GTPγS-binding en proksimal hendelse i GPCR-signalering og, viktigere, kan skille agonisTs, antagonister og inverse agonister. Den foreliggende protokoll beskriver en sensitiv og spesifikk metode for å studere GPCR-signalering ved bruk av råmembranpreparater av en arketypisk GPCR, μ-opioidreseptoren (MOR1). Selv om alternative tilnærminger til fraksjonering av celler og vev eksisterer, er mange kostnadseffektive, kjedelige og / eller krever ikke-standard laboratorieutstyr. Den foreliggende fremgangsmåte gir en enkel prosedyre som beriker funksjonelle råmembraner. Etter isolering av MOR1 ble forskjellige farmakologiske egenskaper av dets agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) og antagonist, nalokson, bestemt.
Introduction
G-proteinkopplede reseptorer (GPCRs) er en stor familie av celleoverflate-reseptorer som er ansvarlige for et bemerkelsesverdig utvalg av fysiologiske prosesser, inkludert analgesi, olfaction og adferd 1 . GPCR'er virker ved å detektere spesifikke eksterne signaler og deretter stimulere intracellulær signalering. De markerer derfor en nøkkelforbindelse mellom de eksterne og interne omgivelsene til en celle. På grunn av den kritiske rollen som GPCR spiller i biologi, har de blitt store mål for både grunnforskning og narkotikaforskning 2 , 3 .
I motsetning til andre reseptorfamilier som binder diskrete ligander, kan GPCRs binde svært forskjellige typer molekyler. Mens en GPCR kan interagere med peptider, kan en annen fornemme fotoner, små molekyler eller ioner 1 , 4 . Mens deres ligander er forskjellige, er GPCRer samlet i deres overordnede arkitektUre og funksjon. Individuelle GPCRs består av syv a-spiralformede transmembranproteiner med ekstracellulære aminoterminaler og intracellulære karboxylterminaler 5 , 6 . GPCRer er koblet til intracellulære G-proteiner-heterotrimeriske proteinkomplekser sammensatt av a-, p- og y-underenheter-som medierer mangfoldige signalveier 7 . G α -underenheten er et guaninukleotidbindende protein som er inaktivt når det er bundet til guanosindifosfat (BNP) og aktivt når det er bundet til guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . Når GPCRer binder deres ligander, gjennomgår de en konformasjonsendring som tillater G α å dissociere fra G β , og derved tillater G α å utveksle BNP for GTP 7 . Reseptoren i seg selv er fosforylert ved sin karboksalterminale av forskjellige serin / treonIne kinaser 10 , 11 og internalisert for å dempe mottakersignalering 12 , 13 , 14 . I mellomtiden fortsetter den aktiverte G a- monomeren og G- β- dimeren for å aktivere forskjellige signalveier 7 . Det er flere isoformer av hver G-protein-underenhet, og hver isoform målretter bestemte nedstrømsbaner og sekundære meldingssystemer. De store G a- isoformene inkluderer G s , G q , G i / o og G 12-13 . Typisk forbinder individuelle GPCR'er med en bestemt G a- isoform, hvorved en ekstern stimulus kobles til en bestemt cellulær respons 1 .
Karakterisering av en GPCR-ligand-interaksjon er kritisk for å forstå biologien til reseptoren. Som BNP / GTP-utveksling er en av de tidligste på kveldenNts som følger ligandbindende, overvåking av GTP-binding kan måle GPCR-aktivering eller -inhibering. Å analysere flere nedstrøms hendelser i GPCR-signalering er ofte ikke så kvantitativ eller støkiometrisk, kan ikke skille full agonister fra delvise, og kan kreve dyre reagenser. Videre er økt GTP-binding til G α -proteiner en nesten universell hendelse etter GPCR-aktivering, noe som betyr at måling av GTP-binding er et bredt anvendbart assay for overvåking av aktiviteten til de fleste GPCRer. Måling av GTP-binding er en enkel og rask tilnærming til å overvåke GPCR-signalering i celler som overuttrykker reseptor av interesse eller i naturlig vev. Den foreliggende protokoll beskriver en funksjonell GTP-bindingsanalyse ved bruk av en arketypisk GPCR, μ-opioidreseptoren (MOR1), for kvantitativt å bestemme aktiviteten til en agonist og antagonist på GPCR-signalering.
Denne protokollen skisserer først hvordan man isolerer råmembraner fra celler som overuttrykker MOR1. Merk degDenne protokollen er ikke begrenset til overekspresjons-systemer og kan påføres mange kilder til membran, inkludert nativt vev eller preparater som uttrykker flere reseptorer og G-proteiner 15 . Protokollen beskriver deretter hvordan man måler bindingen av en radioaktiv GTP-analog til disse membranene som respons på varierende konsentrasjoner av [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) eller nalokson, en MOR1-agonist og antagonist, henholdsvis. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPγS) er ikke hydrolyserbar. Denne egenskapen er kritisk fordi G a- underenheter utviser egen GTPase-aktivitet 7 og vil eliminere det merkede gammafosfat på en hydrolyserbar GTP-radiokjemisk. Membraner blir deretter fanget på glassfiberfiltre og vasket, hvorpå den radiomerkede GTP kvantiseres ved væskescintillasjonstelling. Flere farmakologiske parametere kan utledes av karakteristikkE-reseptor-ligand-interaksjonen, inkludert halv-maksimal respons (EC 50 ) og Hill-koeffisienten (n H ) for agonister og den halv maksimale inhibitoriske konsentrasjonen (IC 50 ) og likevektsdissociasjonskonstanten (K b ) for antagonister 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende protokollen beskriver to separate, men komplementære metoder: En enkel tilnærming til fraksjonering av celler og vev i brede, men tydelige rom og et middel for å undersøke GPCR-signalering ved å måle [35S] GTPγS-binding.
Effektiv cellulær fraksjonering har et bredt spekter av anvendelser, alt fra utvinning og anrikning av proteiner til vurdering av subcellulær lokalisering av proteiner til studier av reseptor farmakologi. Selv om alternative tilnærminger til fraksj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-stipend DA-000266 og Medisinforskerutdanningsprogram T32-stipend (CV, NWZ og PCS). Forfatterne vil også gjenkjenne somersault18: 24 (somersault1824.com) for biblioteket for naturvitenskapelige og medisinske illustrasjoner.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
