Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP
Summary
Связывание гуанозинтрифосфата (GTP) является одним из самых ранних событий активации G-протеин-связанного рецептора (GPCR). Этот протокол описывает, как фармакологически характеризуют специфические взаимодействия GPCR-лиганда путем контроля связывания радиомеченного GTP-аналога, [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS), в Ответ на лиганд, представляющий интерес.
Abstract
G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство трансмембранных рецепторов, которые играют критическую роль в нормальной клеточной физиологии и составляют основную фармакологическую цель для множественных показаний, включая аналгезию, регулирование артериального давления и лечение психических заболеваний. После связывания лиганда GPCR катализируют активацию внутриклеточных G-белков, стимулируя включение гуанозинтрифосфата (GTP). Активированные G-белки затем стимулируют сигнальные пути, которые вызывают клеточные реакции. Передача сигналов GPCR может контролироваться путем измерения включения радиоактивно меченной и негидролизуемой формы GTP, [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS) в G-белки. В отличие от других методов, которые оценивают более длительные процессы сигнализации, связывание [ 35 S] GTPγS измеряет проксимальное событие в передаче сигналов GPCR и, что важно, может различать агонидыTs, антагонисты и обратные агонисты. В настоящем протоколе описывается чувствительный и специфический метод изучения передачи сигналов GPCR с использованием сырых мембранных препаратов архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1). Хотя существуют альтернативные подходы к фракционированию клеток и тканей, многие из них являются дорогостоящими, утомительными и / или требуют нестандартного лабораторного оборудования. Настоящий метод обеспечивает простую процедуру, которая обогащает функциональные сырые мембраны. После выделения MOR1 определяли различные фармакологические свойства его агониста [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (DAMGO) и антагониста налоксона.
Introduction
G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство рецепторов клеточной поверхности, ответственных за замечательный массив физиологических процессов, включая анальгезию, обоняние и поведение 1 . GPCR действуют путем определения специфических внешних сигналов и впоследствии стимулируют внутриклеточную сигнализацию. Поэтому они отмечают ключевое соединение между внешней и внутренней средами ячейки. Из-за важной роли GPCRs в биологии они стали основными целями как для фундаментальных исследований , так и для открытия лекарств 2 , 3 .
В отличие от других семейств рецепторов, которые связывают дискретные лиганды, GPCR могут связывать очень разные типы молекул. В то время как один GPCR может взаимодействовать с пептидами, другой может воспринимать фотоны, малые молекулы или ионы 1 , 4 . Хотя их лиганды разнообразны, GPCRs объединены в своем общем архитектореUre и функции. Отдельные GPCR состоят из семи α-спиральных трансмембранных белков с внеклеточными аминоконцами и внутриклеточными карбоксильными терминалами 5 , 6 . GPCRs связаны с внутриклеточными G-белками-гетеротримерными белковыми комплексами, состоящими из α, β и γ-субъединиц, которые опосредуют различные сигнальные пути 7 . G-субъединица представляет собой гуанин-нуклеотидсвязывающий белок, который неактивен при связывании с гуанозиндифосфатом (ВВП) и активен при связывании с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) 8,9 . Когда GPCR связывают свои лиганды, они подвергаются конформационному изменению, которое позволяет G α диссоциировать из G βγ , тем самым позволяя G α обменивать ВВП для GTP 7 . Сам рецептор фосфорилируется на своем карбоксильном конце различными серинами / треонамиIne kinases 10 , 11 и интернализуется для ослабления сигнализации 12 , 13 , 14 рецептора. Между тем активированный Gα-мономер и димер G βγ продолжают активировать различные сигнальные пути 7 . Существует несколько изоформ каждой субъединицы G-белка, и каждая изоформа нацелена на конкретные нисходящие пути и системы вторичных мессенджеров. Основные изоформы Gα включают G s , G q , G i / o и G 12-13 . Как правило, отдельные GPCR ассоциируются с конкретной изоформой G α , тем самым связывая внешний раздражитель с конкретным клеточным ответом 1 .
Характеристика взаимодействия GPCR-лиганда имеет решающее значение для понимания биологии рецептора. Поскольку обмен ВВП / ГТФ является одним из первыхNts, который следует за связыванием лиганда, мониторинг связывания GTP может измерять активацию или ингибирование GPCR. Анализ большего количества событий в нисходящем потоке в сигнале GPCR часто не является количественным или стехиометрическим, не может отличить полных агонистов от частичных и может потребовать дорогостоящих реагентов. Более того, увеличение связывания GTP с G α- белками является почти универсальным событием после активации GPCR, что означает, что измерение связывания GTP является широко применимым анализом для мониторинга активности большинства GPCR. Измерение связывания GTP является простым и быстрым подходом к мониторингу передачи сигналов GPCR в клетках, сверхэкспрессирующих рецептор, представляющий интерес, или в нативной ткани. В настоящем протоколе подробно описывается анализ функционального GTP-связывания с использованием архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1), чтобы количественно определить активность агониста и антагониста при передаче сигналов GPCR.
В этом протоколе впервые описывается, как изолировать сырые мембраны от клеток, сверхэкспрессирующих MOR1. Обратите внимание, чтоЭтот протокол не ограничивается системами сверхэкспрессии и может быть применен ко многим источникам мембраны, включая нативную ткань или препараты, экспрессирующие множественные рецепторы и G-белки 15 . Затем в протоколе подробно описывается, как измерять связывание радиоактивного аналога GTP с этими мембранами в ответ на различные концентрации [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (ДАМГО) или налоксона, агониста и антагониста MOR1, соответственно. Аналог GTP [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфат ([ 35 S] GTPγS) негидролизуется. Это свойство имеет решающее значение, так как G α- субъединицы проявляют внутреннюю активность GTPase 7 и устраняют меченый гамма-фосфат на гидролизуемом радиотеке GTP. Мембраны затем захватывают на стекловолоконные фильтры и промывают, после чего радиоактивно меченный ГТП определяют количественно с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Множественные фармакологические параметры могут быть получены для характеристикиE) взаимодействие рецептора с лигандом, включая полумаксимальный ответ (EC 50 ) и коэффициент Хилла (n H ) для агонистов и полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ) и константу равновесной диссоциации (K b ) для антагонистов 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем протоколе описаны два отдельных, но взаимодополняющих метода: простой подход к фракционированию клеток и тканей в широкие, но четкие отсеки и средство для исследования передачи сигналов GPCR путем измерения связывания [ 35 S] GTPγS.
Эффективное клеточное фр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грантом DA-000266 и грантом программы T32 для медицинских ученых (CV, NWZ и PCS). Авторы также хотели бы признать somersault18: 24 (somersault1824.com) для Библиотеки наук и медицинских иллюстраций.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
