Mätning av G-proteinkopplad receptorreceptor via radiomärkt GTP-bindning
Summary
Guanosintrifosfat (GTP) -bindning är en av de tidigaste händelserna vid aktivering av G-proteinkopplad receptor (GPCR). Detta protokoll beskriver hur man farmakologiskt karakteriserar specifika GPCR-ligand-interaktioner genom att övervaka bindningen av den radiomärkta GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS), i Svar på en ligand av intresse.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är en stor familj av transmembranreceptorer som spelar kritiska roller i normal cellulär fysiologi och utgör ett viktigt farmakologiskt mål för flera indikationer, inklusive analgesi, blodtrycksreglering och behandling av psykisk sjukdom. Vid ligandbindning katalyserar GPCR: er aktiveringen av intracellulära G-proteiner genom att stimulera införlivandet av guanosintrifosfat (GTP). Aktiverade G-proteiner stimulerar sedan signaleringsvägar som framkallar cellulära reaktioner. GPCR-signalering kan övervakas genom att mäta inkorporeringen av en radiomärkt och icke-hydrolyserbar form av GTP, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS) i G-proteiner. Till skillnad från andra metoder som bedömer mer nedströms signaleringsprocesser, mäter [35S] GTPγS-bindning en proximal händelse vid GPCR-signalering och, viktigare, kan skilja agonisTs, antagonister och inversa agonister. Det föreliggande protokollet beskriver en känslig och specifik metod för att studera GPCR-signalering med användning av råmembranpreparat av en archetypal GPCR, μ-opioidreceptorn (MOR1). Även om alternativa metoder för fraktionering av celler och vävnader finns, är många kostnadseffektiva, tråkiga och / eller kräver icke-standard laboratorieutrustning. Föreliggande metod ger en enkel procedur som berikar funktionella råmembran. Efter isolering av MOR1 bestämdes olika farmakologiska egenskaper hos dess agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) och antagonist, naloxon.
Introduction
G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) är en stor familj av cell-ytreceptorer som är ansvariga för en anmärkningsvärd mängd fysiologiska processer, inklusive analgesi, olfaction och beteende 1 . GPCRs agerar genom att avkänna specifika externa signaler och därefter stimulera intracellulär signalering. De markerar därför en nyckelkorsning mellan en extern och intern miljö. På grund av den viktiga rollen som GPCR spelar i biologi, har de blivit stora mål för både grundforskning och läkemedelsupptäckt 2 , 3 .
Till skillnad från andra receptorfamiljer som binder diskreta ligander kan GPCRs binda mycket olika typer av molekyler. Medan en GPCR kan interagera med peptider kan en annan känna av fotoner, små molekyler eller joner 1 , 4 . Medan deras ligander är olika, är GPCRs förenade i sin övergripande arkitektUre och funktion. Individuella GPCRs består av sju a-spiralformiga transmembranproteiner med extracellulära aminoterminaler och intracellulära karboxylterminaler 5 , 6 . GPCRs är kopplade till intracellulära G-proteiner-heterotrimera proteinkomplex som är sammansatta av a-, p- och y-underenheter-som medierar diverse signalvägar 7 . G a -subenheten är ett guaninukleotidbindande protein som är inaktivt när det är bunden till guanosindifosfat (BNP) och aktivt när det är bunden till guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . När GPCR: er binder sina ligander genomgår de en konformationsförändring som tillåter G a att dissociera från G ^ , så att G a kan utbyta BNP för GTP 7 . Receptorn i sig fosforyleras vid sin karboxylterminal av olika serin / treonIni-kinaser 10 , 11 och internaliserades för att dämpa receptorsignalering 12 , 13 , 14 . Under tiden fortsätter den aktiverade G a – monomeren och G- β- dimeren för att aktivera separata signalvägar 7 . Det finns flera isoformer av varje G-protein-subenhet, och varje isoform riktar sig till specifika nedströmsvägar och sekundära budbärarsystem. De huvudsakliga G a- isoformerna inkluderar G s , G q , G i / o och G 12-13 . Typiskt associerar individuella GPCRs med en särskild G a- isoform, varigenom en extern stimulans kopplas till ett specifikt cellulärt svar 1 .
Att karakterisera en GPCR-ligandinteraktion är kritisk för att förstå receptorens biologi. Som BNP / GTP-utbyte är en av de tidigaste kvällarnaNts som följer ligandbindning, övervakning av GTP-bindning kan mäta GPCR-aktivering eller inhibering. Att analysera mer nedströms händelser i GPCR-signaleringen är ofta inte lika kvantitativ eller stökiometrisk, får inte särskilja fullständiga agonister från partiella sådana och kan kräva dyra reagenser. Dessutom är ökad GTP-bindning till G a -proteiner en nästan universell händelse efter GPCR-aktivering, vilket innebär att mätning av GTP-bindning är en brett tillämplig analys för att övervaka aktiviteten hos de flesta GPCR. Mätning av GTP-bindning är ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för att övervaka GPCR-signalering i celler som överuttrycker receptor av intresse eller i nativ vävnad. Föreliggande protokoll beskriver en funktionell GTP-bindningsanalys med användning av en archetypal GPCR, μ-opioidreceptorn (MOR1) för att kvantitativt bestämma aktiviteten hos en agonist och antagonist vid GPCR-signalering.
Detta protokoll beskriver först hur man isolerar råmembran från celler som överuttrycker MOR1. Notera det härT detta protokoll är inte begränsat till överexpressionssystem och kan appliceras på många källor av membran, inklusive nativ vävnad eller preparat som uttrycker multipla receptorer och G-proteiner 15 . Protokollet beskriver sedan hur man mäter bindningen av en radioaktiv GTP-analog till dessa membraner som svar på varierande koncentrationer av [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) eller naloxon, en MOR1-agonist och antagonist, respektive. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS) är icke hydrolyserbar. Denna egenskap är kritisk eftersom G a- subenheter uppvisar inneboende GTPasaktivitet 7 och skulle eliminera det märkta gammafosfatet på en hydrolyserbar GTP-radiokemisk. Membranerna fångas sedan på glasfiberfiltren och tvättas, varpå den radiomärkta GTP kvantifieras genom vätskescintillationsräkning. Multipla farmakologiska parametrar kan härledas till karakteriseringE-receptor-ligandinteraktionen, innefattande det halvmaximala svaret (EC50) och Hill-koefficienten (nH) för agonister och den halva maximal inhiberande koncentrationen (IC50) och jämviktsdissociationskonstanten (Kb) för antagonister 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Föreliggande protokoll beskriver två separata men komplementära metoder: ett enkelt tillvägagångssätt för fraktionering av celler och vävnader i breda men separata fack och ett medel för att undersöka GPCR-signalering genom att mäta [35S] GTPγS-bindning.
Effektiv cellfraktionering har ett brett användningsområde, allt från extraktion och berikning av proteiner till bedömningen av subcellulär lokalisering av proteiner till studier av receptorfarmakologi. Även om alternativa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Health grant DA-000266 och Medicinsk Vetenskapsutbildningsprogram T32-bidrag (CV, NWZ och PCS). Författarna skulle också vilja erkänna somersault18: 24 (somersault1824.com) för biblioteket för vetenskap och medicinska illustrationer.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
