Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü
Summary
Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.
Abstract
G-Protein Bağlı Reseptörler ( GPCR ), normal hücre fizyolojisinde kritik rol oynayan ve analjezi, kan basıncı regülasyonu ve psikiyatrik hastalığın tedavisi de dahil olmak üzere çoklu endikasyonlar için önemli bir farmakolojik hedef oluşturan transmembran reseptörlerden oluşan geniş bir ailesidir. Ligand bağlama üzerine, GPCR'ler, guanozin trifosfat (GTP) 'nin dahil edilmesini uyararak hücre içi G proteinlerinin aktivasyonunu katalize eder. Aktive edilmiş G proteinleri daha sonra hücresel tepkileri ortaya çıkaran sinyal yollarını uyarırlar. GPCR sinyallemesi, GTP'ye, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPγS) radyo-etiketli ve hidrolize edilemez formunun G-proteinlerine dahil edilmesini ölçerek izlenebilir. Daha aşağı yönlü sinyal verme süreçlerini değerlendiren diğer yöntemlerin aksine [ 35 S] GTPγS bağlanması, GPCR sinyallemesinde proksimal bir olayı ölçer ve önemlisi, agonisTs, antagonistler ve ters agonistler. Bu protokol, bir arketipik GPCR'nin, μ-opioid reseptörünün (MOR1) ham membran preparatlarını kullanarak GPCR sinyalini incelemek için duyarlı ve spesifik bir yöntemi özetlemektedir. Hücre ve dokuları fraksiyon haline getirmek için alternatif yaklaşımlar mevcut olmakla birlikte, çoğu maliyet önleme, sıkıcı ve / veya standart olmayan laboratuar ekipmanları gerektirir. Mevcut yöntem, fonksiyonel ham membranları zenginleştiren basit bir prosedür sağlamaktadır. MOR1'in izole edilmesinden sonra, onun agonisti olan [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) ve antagonisti olan naloksonun çeşitli farmakolojik özellikleri belirlendi.
Introduction
G-Protein Bağlı Reseptörler (GPCR), analjezi, koku alma ve davranış gibi dikkate değer bir dizi fizyolojik sürecin sorumlu olduğu hücre yüzeyi reseptörlerinden oluşan geniş bir ailedir. GPCR'ler spesifik harici sinyalleri algılayarak ve daha sonra hücre içi sinyallemeyi uyararak hareket eder. Bu nedenle, bir hücrenin dış ve iç ortamları arasında önemli bir kavşağa işaret ediyorlar. GPCR'lerin biyolojide oynadığı kritik rol nedeniyle , hem temel araştırmalar hem de ilaç keşfi 2 , 3 için önemli hedefler haline gelmiştir.
Ayrı ligandları bağlayan diğer reseptör ailelerinden farklı olarak, GPCRler çok farklı molekül tiplerini bağlayabilir. Bir GPCR peptitlerle etkileşime geçebilirken, bir diğeri fotonları, küçük molekülleri veya iyonları 1 , 4'ü algılayabilir. Ligandları çeşitlidir, ancak GPCR'ler genel mimarında birleşirUre ve işlev. Bireysel GPCR'ler hücre dışı amino terminalleri ve hücre içi karboksil terminalleri 5 , 6 olan yedi adet α-sarmal transmembran proteinden oluşur. GPCR'ler, α, β ve γ alt birimlerinden oluşan heterotrimerik protein kompleksleri olan çeşitli sinyal yollarına aracılık eden hücre içi G proteinlerine bağlanırlar. G α altbirimi, guanozin difosfata (GDP) bağlandığında inaktif olan ve guanozin trifosfata (GTP) 8 , 9 bağlı olduğunda aktif olan bir guanin nükleotid bağlayıcı proteindir. GPCR'ler ligandlarına bağlandığında, Gα'nın Gβγ'dan ayrılmasına ve böylece Gα'nın GTP 7 için GSYİH'nın değişimine izin verecek şekilde konformasyonel bir değişime uğrarlar. Reseptörün kendisi karboksil terminalinde çeşitli serin / threon tarafından fosforile edilmiştirIne kinazlar 10 , 11 ve reseptör sinyalini zayıflatmak için içselleştirilmiş 12 , 13 , 14 . Bu arada aktive edilmiş G α monomeri ve G βγ dimeri belirgin sinyal yollarını aktive eder 7 . Her bir G-protein alt biriminin birkaç izoformu vardır ve her izoform belirli aşağı yönlü yolları ve ikincil haberci sistemlerini hedeflemektedir. Büyük G α izoformları, G s , G q , G i / o ve G 12-13'ü içerir . Genellikle, bireysel GPCR'ler belirli bir G α izoformuyla ilişkilendirilir, böylece bir dış uyaran belirli bir hücresel tepki 1'e bağlanır.
Bir GPCR-ligand etkileşimini karakterize etmek, reseptörün biyolojisini anlamak için kritik önem taşır. GSYİH / GTP değişimi en erken arifelerden biri olduğu içinLigand bağlanmasını takip eden, GTP bağlanmasını izleyen nts GPCR aktivasyonunu veya inhibisyonunu ölçebilir. GPCR sinyallemesinde daha aşağı olayların tahlil edilmesi genellikle niceliksel ya da stokiometrik değildir, tam agonistleri kısmi olanlardan ayırt etmeyebilir ve pahalı reaktifler gerektirebilir. Dahası, Gα proteinlerine GTP bağlanmasının artması, GPCR aktivasyonunu takiben hemen hemen evrensel bir olaydır; bu, GTP bağlanmasının ölçülmesinin, çoğu GPCR'nin aktivitesini izlemek için genel olarak geçerli bir deney olduğu anlamına gelir. GTP bağlanmasının ölçülmesi, ilgi reseptörünü aşırı ifade eden hücrelerde veya doğal dokuda GPCR sinyallemesinin izlenmesi için basit ve hızlı bir yaklaşımdır. Bu protokol, bir archetypal GPCR, μ-opioid reseptörü (MOR1) kullanarak bir agonist ve antagonist aktivitesini kantitatif olarak GPCR sinyallemesi üzerinde saptamak için kullanılan fonksiyonel bir GTP bağlanma testini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.
Bu protokol ilk önce ham membranların MOR1'i aşırı ifade eden hücrelerden nasıl izole edileceğini açıklar. Bunlara dikkat etBu protokol, aşırı sentezleme sistemleri ile sınırlı değildir ve doğal doku veya çoklu reseptörleri ve G proteinlerini ifade eden preparatlar da dahil olmak üzere, birçok membran kaynağına uygulanabilir 15 . Protokol daha sonra bir MOR1 agonisti ve antagonisti olan [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) veya naloksonun konsantrasyonlarına yanıt olarak bu zarlara bir radyoaktif GTP analoğunun bağlanmasının nasıl ölçüleceğini, sırasıyla. GTP analoğu [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS), hidrolize edilemez. Bu özellik kritiktir çünkü Gα altbirimleri intrinsik GTPaz aktivitesi 7 gösterir ve hidrolize olabilen bir GTP radyokimyası üzerinde etiketli gama fosfatını ortadan kaldıracaktır. Membranlar daha sonra cam elyaf filtrelere bindirilir ve yıkanır, daha sonra radyoetiketlenmiş GTP sıvı sintilasyon sayımı ile nicelendirilir. Karakteristik olarak çoklu farmakolojik parametreler türetilebilirAntagonistler için agonistler için yarı maksimal tepki (EC 50 ) ve tepe katsayısı (n H ) ve yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonu (IC50) ve denge ayrılma sabiti (Kb) de dahil olmak üzere reseptör-ligand etkileşimi 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, iki ayrı fakat birbirini tamamlayan yöntemleri açıklamaktadır: hücreleri ve dokuları geniş ama farklı bölmelere ayırmak için basit bir yaklaşım ve [ 35 S] GTPγS bağlanmasını ölçerek GPCR sinyalizasyonunu araştırmak için bir araç.
Etkili hücre fraksiyonlamanın, proteinlerin ekstraksiyonundan zenginleştirilmesine kadar, proteinlerin hücre altı lokalizasyonunun değerlendirilmesinden, reseptör farmakolojisi araştırmasına kadar geniş bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri DA-000266 ve Tıbbi Bilim Eğitimi Eğitim Programı T32 hibe (CV, NWZ ve PCS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Science and Medicine Illustrations Kütüphanesi için somersault18: 24 (somersault1824.com) olduğunu kabul etmek istiyorlar.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
