Bu yazıda bir PEI / MNP vektörü ve mıknatıslanarak endotel hücrelerine miR verimli, viral olmayan iletimi açıklanır. Bu nedenle, genetik modifikasyon ek olarak, bu yaklaşım, manyetik hücre rehberlik ve MR taranabilirlik sağlar. teknik terapötik hücre ürünleri özelliklerini geliştirmek için de kullanılabilir.
Bugüne kadar, kardiyovasküler hastalıklar için mevcut cerrahi ve farmakolojik tedaviler (CVD) sınırlıdır ve genellikle palyatif. Aynı zamanda, gen ve hücre tedavileri CVD tedavisi için son derece ümit verici bir alternatif yaklaşımlardır. Ancak, gen terapisi birçok klinik uygulaması büyük ölçüde uygun gen iletim sistemlerinin eksikliği ile sınırlıdır. Uygun gen dağıtım vektörlerinin gelişimi hücre tedavisi mevcut sorunlara bir çözüm sağlayabilir. Örneğin yaralı organda sınırlı verimlilik ve düşük hücre tutma gibi belirli mevcut dezavantajların, içinde, uygun hücre mühendisliği ile (yani, genetik) transplantasyondan önce üstesinden gelinebilir. Sunulan protokol, bir polietilenimin süperparamanyetik manyetik nanoparçacık (PEI / MNP) tabanlı bir iletim vektörü kullanılarak endotel hücreleri, verimli ve güvenli geçici modifikasyonu da tarif edilmektedir. Ayrıca, algoritma ve hücre karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. başarılı intracellumikroRNA, insan göbek damarı endotel hücrelerine (MIR) (HUVECler) ve lar dağıtım hücre canlılığı, fonksiyonu veya hücreler arası iletişim etkilemeden elde edilmiştir. Üstelik bu yaklaşım tanıtıldı eksojen miR güçlü fonksiyonel etkiye neden olduğu kanıtlandı. Önemli olarak, bu MNP-esaslı vektörün uygulaması manyetik hedefleme ve invazif olmayan MR izleme olanaklarını eşlik ile hücre mıknatıslanma sağlamaktadır. Bu MR ile non-invazif olarak izlenebilir manyetik destekli, genetik olarak işlenmiş hücre terapötik bir temel teşkil edebilir.
Gen ve hücre terapisi CVD tedavisinde güncel zorlukları çözmek için potansiyele sahip güçlü araçlardır. Bu yaklaşımların her ikisi halen klinik deneylerle test ediliyor olmasına rağmen, henüz geniş klinik uygulamada 1 için hazır değildir. Özellikle, gen ve hücre tedavisi güçlüğün üstesinden gelmek için, ortak bir yaklaşımı, klinik uygulama için uygun olan çok işlevli bir gen iletim vektörleri geliştirmektir. Güvenli ve verimli gen aktarım sistemlerinin eksikliği gen terapisinin önemli konudur. Aynı zamanda, hücresel ürünlerin genetik mühendisliği gibi düşük verim (örneğin, kalp alanında, fonksiyonel iyileşme sadece yaklaşık% 5 elde edilir sonrası kök hücre nakli 1 gibi hücre tedavisinin ciddi zorluklar üstesinden naklinden önce saat po dakika içinde% 10 -) ve zayıf tutma / yaralanma yerinde melezleme (yani, hücre tutma altında 5 damlaSt-uygulama, uygulama yolundan bağımsız 2, 3, 4).
Bugüne kadar, viral vektörler, büyük ölçüde klinik çalışmalarda daha geniş bir uygulama ile sonuçlanmıştır verimlilik açısından viral olmayan sistemler (~% 67) 5 üzerindedir. Ancak, viral araçlar taşınan genetik malzeme 6'nın boyutu ciddi (şiddetli komplikasyonlara ve sonraki enflamatuar tepki,) bu tür immünojenisite gibi riskler, onkojeniklik ve sınırlamaları taşırlar. Bu güvenlik kaygıları ve viral vektör üretiminin yüksek maliyetler nedeniyle, viral olmayan sistemlerin kullanımı bazı durumlarda 7, 8 tercih edilir. Bu, örneğin (CVD tedavisi için, örneğin,) anjiyogenezi kontrol büyüme faktörünün ekspresyonu gibi geçici genetik düzeltme gerektiren bozuklukların veya delive için özellikle uygunduraşıların ry.
Grubumuz, bir iletim sistemi dallı bir 25-kDa 'lık polietilenimin (PEI) ve biyotin-streptavidin interaksiyonundan 9 ile birbirine bağlanmış süperparamanyetik demir oksit nano-tanecikleri (MNT) birleştirilmesi ile tasarlanmıştır. Bu vektör, transplantasyondan önce bunların eşzamanlı olarak manyetizasyon sağlayan hücrelerin genetik mühendisliği için potansiyel bir araçtır. İkincisi, gelişmiş manyetik hedefleme teknikleri başarıyla 10 geliştirilmektedir olarak, günümüzde özellikle umut vericidir manyetik rehberlik / birikmesiyle bağlantılı bir temel oluşturur. Dahası, ortaya çıkan manyetik tepkili hücreler olma potansiyeline sahip olmayan invaziv manyetik rezonans görüntüleme (MRI) veya manyetik parçacık görüntüleme 11, 12 ile izlenebilir.
PEI / MNP vektörü durumunda, poliamin düşürücü etken nükleik asit yoğunlaşmasını ve böylece koruma sağlar s, hücrelerde vektör içselleştirme ve endozomal 5 kaçmak. MNPS manyetik yönlendirme açısından değil, aynı zamanda bilinen PEI toksisite 7, 13, 14 azaltarak, sadece, PEI özelliklerini tamamlar. Daha önce, PEI / MNP vektör özellikleri fibroblastlar ve mezenkimal kök hücreleri 15, 16 kullanılarak temin verimi (yani, pDNA ve miRNA) ve güvenlik açısından ayarlandı.
Bu yazıda, miRNA modifiye edilmiş hücrelerin üretilmesi için PEI / MNPS uygulanması hakkında detaylı bir protokol 17 tarif edilmiştir. Bu amaçla, HUVECler kullanılmış ve in vitro olarak anjiyojenez için kurulmuş bir modelini temsil eder. Onlar transfect zorlu ve toksik etkisi 18, 19 duyarlıdıreşek = "xref"> 20. Buna ek olarak, bunların hedefleme, hücreler arası iletişim, ve MR tespiti de dahil olmak üzere, in vitro olarak bu tür hücreleri, değerlendirmek için bir algoritma sağlar.
Onların bundan başka manyetik kontrollü rehberlik için superparamanyetik nanopartiküller ile yüklü genetik hücrelerin üretimi mevcut protokol sunulmuştur. Bu stratejinin başarılı bir uygulama nakli için hedeflenebilir bir hücre ürünü sunarak, örneğin yaralı alan 2, 3, 4, düşük tutma ve zayıf engraftment olarak hücre tedavisi, bazı zorluklar, çözünürlüğü sağlar. Ayrıca, uygun bir şekilde seç…
The authors have nothing to disclose.
Biz filtrelenmiş superparamanyetik nanopartiküllerin TEM görüntüleri kazanılmasında ve bunların X-ışını analizi yapan teknik destek için G. Fulda (Elektron Mikroskopi Merkezi, Rostock Üniversitesi, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. RTC Rostock yürütülen çalışmalar Federal Eğitim Bakanlığı ve Araştırma Almanya (FKZ 0312138A, FKZ 316.159 ve VIP + 03VP00241) ve AB Yapısal Fonları ile Devlet Mecklenburg-Vorpommern (ESF / IV-WM-B34- tarafından desteklenmiştir 0030/10 ve ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) ve DFG (DA 1296-1), Islak-Vakfı ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12) ile. Frank Wiekhorst AB 7.ÇP araştırma programının "Nanomag" FP7-NMP-2013-BÜYÜK-7 tarafından desteklenmiştir.
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |