Expression de protéines recombinantes, cristallisation et études biophysiques d'une<em> Bacillus</em> Pyrophosphorylase nucléotidique conservée, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis est l'agent pathogène obligatoire du charbon inhalatoire fatal, de sorte que les études de ses gènes et de leurs protéines sont strictement réglementées. Une autre approche consiste à étudier les gènes orthologues. Nous décrivons des études biophysicochimiques d'un orthologue de B. anthracis dans B. cereus , bc1531, nécessitant un matériel expérimental minimal et sans problèmes sérieux de sécurité.
Abstract
Pour surmonter les restrictions et les réglementations de sécurité lors de l'étude des gènes et des protéines à partir de pathogènes vrais, leurs homologues peuvent être étudiés. Bacillus anthracis est un agent pathogène obligatoire qui provoque un inhalation d'anthrax mortel. Bacillus cereus est considéré comme un modèle utile pour étudier B. anthracis en raison de sa relation évolutionniste étroite. Le groupe génétique ba1554 – ba1558 de B. anthracis est fortement conservé avec le groupe bc1531 – bc1535 dans B. cereus , ainsi qu'avec le groupe bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis, indiquant le rôle critique des gènes associés dans le genre Bacillus . Ce manuscrit décrit des méthodes pour préparer et caractériser un produit protéique du premier gène ( ba1554 ) du groupe de gènes de B. anthracis en utilisant une protéine recombinante de son ortholog dans B. cereus , bc1531.
Introduction
L'expression de protéines recombinantes est largement utilisée pour surmonter les problèmes associés aux sources de protéines naturelles, telles que des quantités limitées de protéines et une contamination nocive. De plus, dans les études sur les gènes et les protéines pathogènes, une souche de laboratoire alternative qui ne nécessite pas de précautions de sécurité supplémentaires peut être utilisée. Par exemple, Bacillus cereus est un modèle utile pour étudier Bacillus anthracis en raison de leur relation évolutive 1 .
B. anthracis est un agent pathogène obligatoire qui provoque un inhalation d'anthraxs mortels chez l'homme et le bétail et peut potentiellement être utilisé comme bioweapon 2 . Ainsi, les études de laboratoire sur B. anthracis sont strictement réglementées par les Centers for Disease Control des États-Unis, nécessitant des pratiques de biosécurité de niveau 3 (BSL-3), qui exigent que la zone de laboratoire soit séparée par une pression ambiante négative. Contrairement à B. anthracis </eM>, B. cereus est classé comme un agent BSL-1 et a donc des problèmes de sécurité minimes. B. cereus est un agent pathogène opportuniste qui, lors d'une infection, provoque des intoxications alimentaires qui peuvent être traitées sans assistance médicale. Cependant , parce que B. cereus partage de nombreux gènes critiques avec B. anthracis , les fonctions des protéines de B. anthracis peuvent être étudiées en utilisant les homologues correspondants de B. cereus 1 .
Le groupe de gènes ba1554 – ba1558 de B. anthracis est fortement conservé avec le cluster bc1531 – bc1535 De B. cereus , ainsi qu'avec le groupe bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , en termes d'organisation et de séquence de gènes. En outre, les premiers gènes ( ba1554 , bc1531 et bt1364 ) des grappes respectives sont absolument conservés ( c.-à-d., Identité de séquence à 100% de nucleotide), impieUn rôle critique du produit génique dans les espèces de Bacillus . En raison de son emplacement dans ces grappes de gènes, ba1554 a été mal identifié comme un régulateur de transcription putatif 3 . Cependant, l'analyse de la séquence d'acides aminés du produit ba1554 indique qu'il appartient à la famille MazG, qui a une activité nucléotidique pyrophosphohydrolase et n'est pas associée à l'activité 4 , 5 du facteur de transcription. Bien que les protéines appartenant à la famille MazG soient diverses en ce qui concerne la séquence et la longueur globales, elles partagent un domaine MazG ~ 100 résidus commun caractérisé par un motif EXXE 12-28 EXXD ("X" représente tout résidu d'acide aminé et le nombre Indique le nombre de résidus X).
Le domaine MazG ne reflète pas toujours directement une certaine activité catalytique. Un membre MazG d' Escherichia coli (EcMazG) possède deux domaines MazG, mais surLe domaine C-terminal MazG est enzymatiquement actif 6 . De plus, la spécificité du substrat des enzymes MazG varie en fonction des nucléosides triphosphates non spécifiques (pour EcMazG) vers dCTP / dATP spécifique (pour MazG associée à l'intégrine) et dUTP (pour dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Par conséquent, des analyses bio-physicochimiques de la protéine BA1554 sont nécessaires pour confirmer son activité NTPase et déchiffrer sa spécificité de substrat.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape que la plupart des laboratoires sans installation de BSL-3 peuvent suivre pour caractériser le produit protéique du gène B. cereus bc1531 , qui est un orthologue de B. anthracis ba1554 , au niveau moléculaire. En bref, BC1531 recombinant (rBC1531) a été exprimé dans E. coli et purifié en utilisant une étiquette d'affinité. Pour les expériences cristallographiques aux rayons X, le cristallisLes conditions de zation de la protéine rBC1531 ont été criblées et optimisées. Pour évaluer l'activité enzymatique du rBC1531, l'activité NTPase a été surveillée colorimétriquement pour éviter les nucléotides marqués par radioactivité qui ont été utilisés classiquement. Enfin, les analyses des données bio-physicochimiques obtenues nous ont permis de déterminer l'état d'oligomérisation et les paramètres catalytiques de RBC1531, ainsi que d'obtenir des données de diffraction des rayons X du cristal RBC1531.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les jeux de données de diffraction des rayons X ont été collectés à la ligne de faisceau 7A du Pohang Accelerator Laboratory (Corée). Cette étude a été soutenue par le programme de recherche scientifique de base administré par la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF), financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future (2015R1A1A01057574 à MH).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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