재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구<em> 바실러스</em> 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저의 병원성 물질이기 때문에 유전자와 단백질에 대한 연구가 엄격히 규제됩니다. 또 다른 접근법은 orthologous 유전자를 연구하는 것이다. B. cereus 의 B. anthracis ortholog (bc1531)에 대한 생물학적 물리 화학적 연구는 최소한의 실험 장비를 필요로하며 심각한 안전 문제가 없다고 설명합니다.
Abstract
진정한 병원체에서 유전자와 단백질을 연구 할 때 안전 제한과 규제를 극복하기 위해 동질성을 연구 할 수 있습니다. Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 절대 병원균입니다. Bacillus cereus 는 B. anthracis 를 가까운 진화 관계로 연구하는 데 유용한 모델로 간주됩니다. B. anthracis 의 유전자 클러스터 ba1554 – ba1558 은 Bacillus thuringiensis 의 bt1364 – bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 bc1531 – bc1535 클러스터와 잘 보존되어 있으며 Bacillus 속의 관련 유전자의 중요한 역할을 나타낸다. 이 원고는 B. cereus , bc1531 에서 ortholog의 재조합 단백질을 사용하여 B. anthracis 의 유전자 클러스터에서 첫 번째 유전자 ( ba1554 )의 단백질 생성물을 준비하고 특성화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
재조합 단백질 발현은 제한된 단백질 양 및 유해한 오염과 같은 천연 단백질 공급원과 관련된 문제점을 극복하기 위해 널리 사용됩니다. 또한 병원성 유전자와 단백질 연구에서 추가적인 안전 예방 조치가 필요없는 대체 실험실 균주를 이용할 수 있습니다. 예를 들어, Bacillus cereus 는 Bacillus anthracis 를 가까운 진화 적 관계 로 연구하는데 유용한 모델이다.
B. 탄저균은 사람과 가축에서 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 필수 병원체이며 잠재적으로 생물 표지 2 로 사용될 수 있습니다. 따라서 B. anthracis 에 대한 실험실 연구는 BSL-3 (생물 안전성 수준 3) 관행을 요구하는 미국 질병 통제 센터 (Centers for Disease Control)에 의해 엄격히 규제되며 실험실 구역을 음의 실내 압력으로 격리하도록 요구합니다. B. anthracis 와는 대조적으로 </eB. cereus 는 BSL-1 약제로 분류되어 안전에 대한 염려가 거의 없다. B. cereus 는 감염시 식중독을 일으키는 기회 주의적 병원균으로 의료 지원없이 치료할 수 있습니다. 그러나 B. cereus 는 B. anthracis 와 많은 중요한 유전자를 공유하기 때문에 B. cereus 1의 동족체를 사용하여 B. anthracis 단백질의 기능을 연구 할 수 있습니다.
B. anthracis 의 ba1554 – ba1558 유전자 클러스터는 bc1531 – bc1535 클러스터와 잘 보존되어있다. Bacillus thuringiensis 의 bt1364-bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 유전자 조직 및 염기 서열에 관한 것이다. 또한, 각 클러스터의 첫 번째 유전자 ( ba1554 , bc1531 및 bt1364 )는 절대적으로 보존되어 있습니다 ( 예 : 100 % 염기 서열 동일성). implyiBacillus 종에서 유전자 산물의 결정적인 역할. 이러한 유전자 클러스터에서의 위치 때문에, ba1554 는 추정 전사 조절 자로 오인되었다. 그러나 ba1554 산물의 아미노산 서열 분석은 MazG family에 속하는 것으로 나타 났는데, 이는 nucleotide pyrophosphohydrolase 활성을 가지고 있으며 전사 인자 활성과 관련이 없다 4 , 5 . MazG 계열에 속하는 단백질은 전체 서열과 길이가 다양하지만 EXXE 12-28 EXXD 모티프로 특징 지워지는 ~ 100 잔기의 MazG 도메인을 공유합니다 ( "X"는 아미노산 잔기를 의미하고 번호 X 잔기의 수를 나타낸다).
MazG 도메인은 특정 촉매 활동을 직접적으로 설명하지는 않습니다. Escherichia coli (EcMazG)의 MazG 구성원은 2 개의 MazG 도메인을 보유하고 있지만C 말단 MazG 도메인은 효소 적으로 활성이다 6 . 또한, MazG 효소의 기질 특이성은 비특이적 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (EcMazG의 경우)에서 특정 dCTP / dATP (인테그린 관련 MazG의 경우) 및 dUTP (dUTPases의 경우) 6 , 7 , 8 , 9로 다양합니다. 따라서 BA1554 단백질의 생물 물리 화학적 분석은 NTPase 활성을 확인하고 기질 특이성을 해독하기 위해 필요하다.
여기에 BSL-3 시설이없는 대부분의 실험실이 분자 수준에서 B. anthracis ba1554 의 ortholog 인 B. cereus bc1531 유전자의 단백질 생성물을 특성화하기 위해 따라갈 수있는 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 간단히, 재조합 BC1531 (rBC1531)을 대장균 에서 발현 시키고 친 화성 태그를 사용하여 정제 하였다. X 선 결정학 실험에서 결정rBC1531 단백질의 zation 조건을 스크리닝하고 최적화 하였다. rBC1531의 효소 활성을 평가하기 위해, NTPase 활성을 비색계로 모니터링하여 통상적으로 사용 된 방사성 표지 된 뉴클레오타이드를 회피 하였다. 마지막으로, 얻어진 생 물리 화학적 데이터의 분석은 rBC1531 결정으로부터 X- 선 회절 데이터를 얻는 것뿐만 아니라 rBC1531의 올리고머 화 상태 및 촉매 매개 변수를 결정할 수있게했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
X 선 회절 데이터 세트는 포항 가속기 연구소 (한국)의 빔라인 7A에서 수집되었다. 이 연구는 과학 기술부, ICT 및 미래 계획 (2015R1A1A01057574, MH)이 자금을 지원하는 국립 과학 재단 (NRF)을 통해 관리되는 기초 과학 연구 프로그램의 지원을 받았다.
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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