Rekombinant Proteinuttrykk, Krystallisering og Biofysiske Studier av a<em> Bacillus</em> -konserverte nukleotidpyrofosforylase, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis er det obligatoriske patogenet for dødelig inhalasjonsantrax, så studier av dets gener og proteiner er strengt regulert. En alternativ tilnærming er å studere ortopologiske gener. Vi beskriver biofysikk-kjemiske studier av en B. antracis ortholog i B. cereus , bc1531, som krever minimal eksperimentelt utstyr og mangler alvorlige sikkerhetsproblemer.
Abstract
For å overvinne sikkerhetsrestriksjoner og forskrifter når man studerer gener og proteiner fra ekte patogener, kan deres homologer bli studert. Bacillus anthracis er et obligatorisk patogen som forårsaker dødelig inhalasjons miltbrand. Bacillus cereus anses som en nyttig modell for å studere B. antracis på grunn av dens nære evolusjonære forhold. Genklyngen ba1554 – ba1558 av B. antracis er sterkt konservert med bc1531 – bc1535 klyngen i B. cereus , samt med bt1364-bt1368 klyngen i Bacillus thuringiensis, som indikerer den kritiske rollen til de tilknyttede gener i Bacillus slekten. Dette manuskriptet beskriver metoder for å forberede og karakterisere et proteinprodukt av det første genet ( ba1554 ) fra genklyngen i B. antracis ved bruk av et rekombinant protein av dets ortholog i B. cereus , bc1531.
Introduction
Rekombinant proteinuttrykk er mye brukt til å overvinne problemer forbundet med naturlige proteinkilder, for eksempel begrensede proteinmengder og skadelig forurensning. Videre kan i en studie av patogene gener og proteiner benyttes en alternativ laboratoriestamme som ikke krever ytterligere sikkerhetsforanstaltninger. For eksempel er Bacillus cereus en nyttig modell for å studere Bacillus anthracis på grunn av deres nære evolusjonære forhold 1 .
B. antracis er et obligatorisk patogen som forårsaker dødelig inhalasjons miltbrand i mennesker og husdyr og kan potensielt brukes som bioweapon 2 . Dermed er laboratorieundersøkelser på B. antracis strengt regulert av US Centers for Disease Control, som krever biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) praksis, som mandatiserer laboratorieområdet segregert med negativt romtrykk. I motsetning til B. antracis </eM>, B. cereus er kategorisert som et BSL-1-agent og har dermed minimal sikkerhetsproblemer. B. cereus er et opportunistisk patogen som ved infeksjon forårsaker matforgiftning som kan behandles uten medisinsk hjelp. Men fordi B. cereus deler mange kritiske gener med B. antracis , kan funksjonene til B. antracis proteiner studeres ved hjelp av tilsvarende homologer av B. cereus 1 .
Ba1554 – ba1558 genklyngen av B. antracis er sterkt konservert med bc1531 – bc1535 klyngen Av B. cereus , så vel som med bt1364-bt1368 klyngen av Bacillus thuringiensis , når det gjelder genorganisasjon og sekvens. Videre er de første gener ( ba1554 , bc1531 og bt1364 ) av de respektive klynger helt konservert ( dvs. 100% nukleotidsekvensidentitet), implisittNg en kritisk rolle for genproduktet i Bacillus- arten. På grunn av sin plassering i disse genklyngene var ba1554 feilidentifisert som en antatt transkripsjonsregulator 3 . Imidlertid indikerer aminosyresekvensanalyse av ba1554- produktet at det tilhører MazG-familien, som har nukleotidpyrofoshydrolaseaktivitet og ikke er assosiert med transkripsjonsfaktoraktivitet 4 , 5 . Selv om proteiner tilhørende MazG-familien er forskjellige med hensyn til generell sekvens og lengde, deler de et felles MazG-domene med 100 rester, karakterisert ved et EXXE 12-28 EXXD-motiv ("X" står for en hvilken som helst aminosyrerest, og tallet Angir antall X rester).
MazG-domenet tar ikke alltid ansvar for en bestemt katalytisk aktivitet. Et MazG-medlem fra Escherichia coli (EcMazG) har to MazG-domener, men påDet C-terminale MazG-domenet er enzymatisk aktivt 6 . Videre varierer substratspecifikiteten av MazG-enzymer fra ikke-spesifikke nukleosidtrifosfater (for EcMazG) til spesifikk dCTP / dATP (for integrin-assosiert MazG) og dUTP (for dUTPaser) 6 , 7 , 8 , 9 . Derfor er biofysisk-kjemiske analyser av BA1554-proteinet nødvendige for å bekrefte NTPase-aktiviteten og for å dekode dens substratspecifikitet.
Her gir vi en trinnvis protokoll som de fleste laboratorier uten et BSL-3-anlegg kan følge for å karakterisere proteinproduktet fra B. cereus bc1531- genet, som er en ortholog av B. antracis ba1554 , på molekylivå. Kort fortalt ble rekombinant BC1531 (rBC1531) uttrykt i E. coli og renset ved anvendelse av en affinitetsmerking. For røntgenkrystallografiske eksperimenter, krystallisererZationbetingelsene for rBC1531-proteinet ble screenet og optimalisert. For å vurdere den enzymatiske aktiviteten til rBC1531 ble NTPaseaktiviteten overvåket kolorimetrisk for å unngå radioaktivt merkede nukleotider som er blitt anvendt konvensjonelt. Til slutt muliggjorde analyser av de oppnådde biofysisk-kjemiske data oss å bestemme oligomeriseringstilstanden og katalytiske parametrene til rBC1531, samt å oppnå røntgendiffraksjonsdata fra rBC1531-krystallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Røntgendiffraksjonsdatasettene ble samlet ved strålelinje 7A i Pohang Accelerator Laboratory (Korea). Denne studien ble støttet av grunnforskningsprogrammet administrert gjennom Nasjonalt forskningsstiftelse i Korea, finansiert av departementet for naturvitenskap, IKT og fremtidig planlegging (2015R1A1A01057574 til MH).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
- Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
- Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
- Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
- Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG — a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
- Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
- Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
- Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
- Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
- Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).
- Brown, T. A. . Gene cloning an introduction. , (1986).
- Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
- Sheehan, D. . Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).
- Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
- Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).
