Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse
Summary
Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.
Abstract
Vetdruppels zijn essentieel voor de replicatie van een aantal verschillende pathogenen, het meest opvallend de Hepatitis C Virus (HCV), de vermoedelijke plaats van virion morfogenese. Kwantitatieve proteoomanalyse lipide druppeltje kan worden gebruikt om eiwitten die gelokaliseerd worden of worden verplaatst vanuit vetdruppels onder omstandigheden zoals virusinfecties identificeren. Hier beschrijven we een protocol dat met succes is gebruikt om de veranderingen in de lipide druppel proteoom na infectie met HCV te karakteriseren. Wij gebruiken Stabiele isotopen met aminozuren in Cell Culture (SILAC) en daarmee labelen totale proteoom van een populatie van cellen met "zware" aminozuren om de eiwitten te kwantificeren door massaspectrometrie. Op lipide druppel isolatie worden de twee celpopulaties (dat wil zeggen met HCV geïnfecteerde / "light" aminozuren en niet-geïnfecteerde controle / "zware" aminozuren) gemengd 1: 1 en mechanisch gelyseerd in hypotonische buffer. Na verwijdering van de kernen en cellen debris door lage snelheid centrifugatie worden lipide-druppeltjes geassocieerde eiwitten verrijkt met twee opeenvolgende stappen ultracentrifugatie gevolgd door drie wasstappen in isotone buffer. De zuiverheid van het lipide druppel fracties geanalyseerd met Western blotting met antilichamen die verschillende subcellulaire compartimenten. Lipide-druppeltjes geassocieerde eiwitten worden vervolgens gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door Coomassie kleuring. Na tryptische digestie worden de peptiden gekwantificeerd door vloeistofchromatografie-electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS). Met deze methode, we geïdentificeerde eiwitten gerekruteerd lipidedruppeltjes bij HCV-infectie die pro- of antivirale gastheerfactoren kunnen vertegenwoordigen. De werkwijze kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende cellen en kweekomstandigheden, zoals infectie met pathogenen, stress of behandeling met geneesmiddelen.
Introduction
Vetdruppels die aan snelle veranderingen cytoplasmatische (nucleus) celorganellen bestaande uit een kern van neutrale lipiden (triglycerides (TG) en cholesterol ester (CE)) omsloten door een monolaag van fosfolipiden met ingebedde eiwitten 1. Alle soorten cellen produceren vetdruppels, maar ze variëren in grootte, lipidesamenstelling, en eiwitten decoratie. Vetdruppels vervullen verschillende functies, waaronder het dienen als energie en membraan precursor reservoirs of eiwitafzettingen. Bovendien, door de opname van lipiden, zij beschermen cellen tegen lipotoxicity, afgifte lipiden zoals signaalmoleculen en zijn betrokken bij eiwitafbraak en endoplasmatisch reticulum (ER) stressrespons 2. Als zodanig kan een groot aantal proteïnen binden aan vetdruppels en bepalen hun generatie, afbraak, handel en interactie met andere organellen. Onder hen zijn de perilipin familie van bona fide lipide druppel bindende eiwitten (PLIN1-5)f "> 3.
Lipide druppeltje biogenese waarschijnlijk vanaf het ER, waarin ER-resident enzymen katalyseren de bereiding van neutrale lipiden die zich ophopen in het membraan bilaag, waardoor een lens van neutrale lipiden, een werkwijze die onlangs mooi werd zichtbaar in gist 4. Membraan buigen en verhoogde fosfatidinezuur en diacylglycerol niveaus worden vervolgens gedacht dat eiwitten die bij fosfolipide biosynthese aantrekken de gelijktijdige synthese van de kern neutrale lipiden en fosfolipiden afscherming nodig is voor lipide droplet generation 5. Enzymen huisvesten transmembraandomeinen die de ER bevinden dit proces katalyseren. Uitbreiding naar grote vetdruppels vereist de activiteit van een andere klasse van lipide-synthetiserende enzymen die een amfipathische helix haven en dus reizen van het ER naar vetdruppels. De mobilisatie van lipiden uit vetdruppels gebeurt via de lokale activatie van het triglyceridee en diacylglycerollipasen adipose triglyceride lipase (ATGL) en hormoongevoelige lipase (HSL) of door verschillende autofagocytische routes, zoals macro- en microlipophagy of chaperonne-gemedieerde autofagie 6. Lipidedruppeltjes interactie met andere cellulaire organellen, zoals mitochondriën (voor beta-oxidatie en lipidesynthese) en ER (voor lipidesynthese en eiwittransport), maar ook met lysosomen, endosomen en vacuolen geïnduceerd door intracellulaire bacteriën 7. Inderdaad bacteriën, virussen, en zelfs parasieten richten vetdruppels voor replicatie en persistentie, waaronder HCV 8.
HCV-infectie is een van de belangrijkste oorzaken van lever-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit wereldwijd, goed voor ongeveer 0,5 miljoen doden per jaar 9. Het werkelijke aantal HCV-infecties is onbekend, maar recente schattingen suggereren dat 130-150.000.000 mensen chronisch geïnfecteerd. geen vaccine bestaat, maar de onlangs goedgekeurde direct-werkende antivirale middelen drastisch verhogen van de therapeutische respons vergeleken met de standaard-interferon gebaseerde therapie. Echter, de hele wereld, de behandeling van patiënten zullen waarschijnlijk worden beperkt als gevolg van de extreem hoge kosten van de nieuwe therapieën. Ongeveer de helft van alle personen die chronisch geïnfecteerd zijn met HCV te ontwikkelen leververvetting (steatose), een aandoening gekenmerkt door de buitensporige accumulatie van vetdruppels in levercellen. Intrigerend vetdruppels voren tevens als vitale cellulaire organellen voor HCV-replicatie, vermoedelijk dienende virale assemblagesites 10, 11.
In HCV-geïnfecteerde cellen, het virale eiwit en NS5A kern lokaliseren lipide druppeltjes in een proces dat afhangt triglyceridebiosynthese, als remmers van diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) aantasting handel lipide druppeltjes en daaropvolgende HCV deeltjesproducie 12 </sup>, 13, 14, 15. Bovendien mutaties in het lipide-droplet bindende domeinen van zowel kern- of NS5A onderdrukken HCV samenstel 16, 17. Kern en NS5A rekruteren dan alle andere virale eiwitten, alsook virale RNA-replicatie complexen membranen nauw verbonden met vetdruppels 16. Een samenspel van alle virale eiwitten is vereist voor de succesvolle productie van infectueuze virale nakomelingen 10, 11. De structurele proteïnen zijn deel van de virions, en de niet-structurele eiwitten bevorderen eiwit-eiwitinteracties vereist voor dit proces. Intrigerend is de bona fide lipide-droplet bindingseiwit PLIN3 / TIP47 vereist zowel HCV-RNA-replicatie en afgifte van virions 18, 19 <sup>, 20. Ondanks deze recente ontwikkelingen, de mechanistische gegevens, in het bijzonder van het virus-gastheer interacties tijdens de late stadia van HCV replicatie, blijven slecht gedefinieerd, en de precieze functie van de vetdruppels is onbekend.
Hier beschrijven we een werkwijze voor vetdruppels te isoleren voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten. Met deze methode, hebben we diepgaande veranderingen in het lipide druppel proteoom tijdens HCV infectie en geïdentificeerd annexine A3 als gastheer eiwit dat co-fractioneert met vetdruppels en is vereist voor efficiënte HCV rijping 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een protocol lipidedruppeltjes isoleren kwantitatieve lipide druppel proteoom analyse om de verrijking en verarming van eiwitten geassocieerd met vetdruppels onder diverse kweekomstandigheden, zoals virale infecties te vergelijken. Als alternatieve werkwijze kan het proteoom analyse uitgevoerd met labelvrije kwantificering basis van totale piekintensiteiten. Deze methode heeft geen beperking dynamisch bereik en voorkomt stofwisselingsproblemen. Het voordeel van de SILAC benadering is dat de monsters …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken R. Bartenschlager (Universiteit van Heidelberg) voor de Jc1 constructies, CM Rice (Rockefeller University) voor de Huh7.5 cellen, J. McLauchlan (Medical Research Council Virologie Unit) voor de JFH1 bouwen, T. Wakita (National Institute of infectieziekten, Japan) voor JFH1 en B. Webster en WC Greene (Gladstone Instituut voor Virologie en Immunologie) voor HCVcc reporter constructen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 en INST 337 / 16-1 2.013 (HS)). De Heinrich Pette Institute, Leibniz Instituut voor Experimentele Virologie wordt ondersteund door de Vrije Hanzestad Hamburg en het ministerie van Volksgezondheid. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide – filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3′ untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3’UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
