Isolamento Droplet per l'analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa
Summary
gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.
Abstract
gocce lipidiche sono vitali per la replica di una varietà di diversi agenti patogeni, il più prominente il virus dell'epatite C (HCV), come il sito putativo di virione morfogenesi. Quantitativa analisi proteomica lipidico gocciolina può essere utilizzato per identificare proteine che localizzano o sono spostati da goccioline lipidiche in condizioni come le infezioni virali. Qui, descriviamo un protocollo che è stato usato con successo per caratterizzare i cambiamenti nel proteoma lipidi goccioline dopo l'infezione da HCV. Usiamo isotopo stabile scrittura con amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) e quindi identificarla proteoma completo di una popolazione di cellule con acidi "pesanti" amminoacidi per quantificare le proteine mediante spettrometria di massa. Per l'isolamento di lipidi gocciolina, le due popolazioni cellulari (cioè / amminoacidi "leggeri" infezione da HCV e / amminoacidi "pesanti" non infetti controllo) vengono mescolati 1: 1 e lisate in tampone ipotonico meccanicamente. Dopo aver rimosso i nuclei e cellule debris mediante centrifugazione a bassa velocità, lipidi proteine gocciolina-associata si arricchiscono di due fasi successive ultracentrifugazione seguiti da tre fasi di lavaggio in tampone isotonico. La purezza delle frazioni goccioline lipidiche viene analizzato mediante western blotting con anticorpi che riconoscono differenti compartimenti subcellulari. Lipidi proteine gocciolina associate sono quindi separati mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE), seguita da colorazione con Coomassie. Dopo triptica digest, i peptidi vengono quantificati mediante cromatografia spettrometria di massa elettrospray-ionizzazione-tandem liquida (LC-ESI-MS / MS). Usando questo metodo, abbiamo identificato proteine reclutati goccioline lipidiche upon HCV che potrebbero rappresentare fattori dell'ospite pro o antivirali. Il nostro metodo può essere applicato a una varietà di diverse cellule e condizioni di coltura, come l'infezione da agenti patogeni, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.
Introduction
Goccioline lipidiche sono altamente dinamici organelli cellulari citoplasmatiche (e nucleari) composte da un nucleo di lipidi neutri (trigliceridi (TG) e esteri del colesterolo (CE)) racchiusa da un monostrato di fosfolipidi con proteine incorporate 1. Tutti i tipi di cellule producono goccioline lipidiche, ma sono di dimensioni variabili, composizione lipidica, e la decorazione delle proteine. goccioline lipidiche svolgono diverse funzioni, tra cui quella di serbatoi di energia e precursori membrana o come depositi di proteine. Inoltre, attraverso l'assorbimento dei lipidi, proteggono le cellule da lipotossicità, lipidi rilascio come molecole di segnalazione, e sono coinvolti nella degradazione delle proteine e reticolo endoplasmatico (ER) di stress risposte 2. Come tale, una serie di proteine si legano a gocce lipidiche e governare la loro generazione, il degrado, il traffico, e l'interazione con altri organelli. Tra loro ci sono la famiglia perilipin di buona fede proteine leganti dei lipidi delle gocce (PLIN1-5)f "> 3.
Lipidi droplet biogenesi probabile inizia al ER, in cui gli enzimi ER residente catalizzano la sintesi dei lipidi neutri che si accumulano all'interno del doppio strato di membrana, formando una lente di lipidi neutri, un processo che è stato recentemente visualizzato bene in lievito 4. Membrana piegatura e livelli elevati di acido e diacilglicerolo fosfatidici vengono quindi pensato di ottenere proteine coinvolte nella biosintesi dei fosfolipidi, come la sintesi simultanea di lipidi neutri core e fosfolipidi schermatura necessaria per la generazione dei lipidi droplet 5. Gli enzimi che ospitano domini transmembrana che risiedono presso il pronto soccorso catalizzano questo processo. Espansione a grandi goccioline lipidiche richiede l'attività di una diversa classe di enzimi lipidi sintetizzare che ospitano un'elica anfipatica e possono quindi viaggiare dal ER goccioline lipidiche. La mobilitazione dei lipidi dal goccioline lipidiche avviene attraverso l'attivazione locale del triglicerideee diacilglicerolo lipasi lipasi adiposo trigliceridi (ATGL) e ormone-sensibile lipasi (HSL) oppure differenti vie autofagici, come macro e microlipophagy o autofagia 6 chaperone-mediata. Goccioline lipidiche interagiscono con altri organelli cellulari, come i mitocondri (per beta-ossidazione e sintesi dei lipidi) e ER (per la sintesi dei lipidi e proteina trafficking), ma anche con i lisosomi, endosomi, e vacuoli intracellulari indotte da batteri 7. Infatti batteri, virus, parassiti e persino indirizzare goccioline lipidiche per la replica e persistenza, tra i quali HCV 8.
L'infezione da HCV è una delle principali cause di morbilità correlata al fegato e la mortalità in tutto il mondo, che rappresentano circa 0,5 milioni di morti all'anno 9. Il vero numero di infezioni da HCV è sconosciuta, ma recenti stime suggeriscono che 130 – 150 milioni di persone sono cronicamente infette. No vaccine esiste, ma i farmaci antivirali ad azione diretta recentemente approvate drammaticamente aumentare le risposte terapeutiche rispetto alla terapia standard a base di interferone. Tuttavia, a livello mondiale, il trattamento di pazienti sarà probabilmente limitato a causa degli elevatissimi costi delle nuove terapie. Circa la metà di tutti gli individui cronicamente infettati con HCV sviluppano la malattia del fegato grasso (steatosi), una condizione caratterizzata da un accumulo eccessivo di gocce lipidiche in epatociti. Curiosamente, gocce lipidiche sono emerse anche organelli cellulari come essenziali per la replicazione di HCV, putatively servire come siti di assemblaggio virale 10, 11.
Nelle cellule con infezione da HCV, il nucleo proteina virale e NS5A localizzano di goccioline lipidiche in un processo che dipende biosintesi trigliceridi, come inibitori di diacilglicerolo aciltransferasi-1 (DGAT1) compromettere la tratta di goccioline lipidiche e produzione di particelle successiva HCV 12 </sup>, 13, 14, 15. Inoltre, mutazioni nei lipidi domini goccioline di legame di entrambi core o NS5A sopprimono assemblaggio di HCV 16, 17. Core e NS5A quindi assumere tutte le altre proteine virali, e anche complessi replicazione RNA virale, alle membrane strettamente associati lipidi goccioline 16. È necessaria un'azione concertata di tutte le proteine virali per la produzione di successo infettiva progenie virale 10, 11. Le proteine strutturali sono parte dei virioni, e le proteine non strutturali promuovono le interazioni proteina-proteina necessari per questo processo. Curiosamente, la bona fide lipidi droplet-binding protein PLIN3 / TIP47 è necessario sia per HCV RNA replicazione e il rilascio di virioni 18, 19 <sup>, 20. Nonostante questi recenti progressi, i dettagli meccanicistici, in particolare di interazione virus-ospite durante le ultime fasi della replicazione di HCV, restano mal definita, e la funzione precisa delle gocce lipidiche è sconosciuta.
Qui, si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine associate. Usando questo metodo, abbiamo trovato profondi cambiamenti nel proteoma lipidi droplet durante l'infezione da HCV e identificato annessina A3 come proteina ospite che co-fraziona con goccioline lipidiche e richiesto per una efficiente HCV maturazione 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per isolare goccioline lipidiche per l'analisi quantitativa dei lipidi droplet proteoma per confrontare l'arricchimento e l'esaurimento di proteine associate con goccioline lipidiche in condizioni di coltura diversi, come le infezioni virali. Come metodo alternativo, l'analisi proteomica può essere eseguita con quantificazioni label-free basati sul totale intensità di picco. Questo metodo non ha limitazioni gamma dinamica ed evita problemi metabolici. Il vantaggio d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo R. Bartenschlager (Università di Heidelberg) per i costrutti Jc1, CM Rice (Rockefeller University) per le cellule Huh7.5, J. McLauchlan (Virologia Unità di Medical Research Council) per la costruzione, T. Wakita (Istituto Nazionale di JFH1 Malattie infettive, Giappone) per il JFH1, e B. Webster e WC Greene (Gladstone Istituto di Virologia e Immunologia) per i costrutti reporter HCVcc. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi della DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 e INST 337 / 16-1 il 2013 (HS)). Il Heinrich Pette Institute, Istituto Leibniz per Sperimentale Virologia è sostenuto dalla Città Libera e Anseatica di Amburgo e il Ministero federale della sanità. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
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