एक बहु-छेद cryovial समाप्त कलाकृतियों बर्फ़ीली जब मांसपेशियों के ऊतकों सीधे तरल नाइट्रोजन में डूबे हैं
Summary
यह प्रोटोकॉल उन्हें तरल नाइट्रोजन में सीधे जल्दी से आगे बढ़नेवाला से मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। यह प्रोटोकॉल भी एक नया cryovial कि नाइट्रोजन गैस की "कंबल प्रभाव" से बच सकते हैं पर प्रकाश डाला गया जब तरल नाइट्रोजन संपर्क एक नमूना के ऊतक सतह।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान पर अध्ययन उचित रूप से नमूनों प्रसंस्करण स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बों के साथ वर्गों प्राप्त करने के लिए की तकनीकी चुनौती का सामना। एक और बाधा आसपास के ऊतकों को myofibers की तंग समानाधिकरण है। क्योंकि ऊतक निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग की प्रक्रिया मांसपेशी फाइबर के दबाव की ओर जाता है, ठंड सेक्शनिंग के लिए मांसपेशियों के ऊतकों सख्त का एक इष्टतम साधन है। हालांकि, एक आम तौर पर सामना करना पड़ा मुद्दा, बर्फ के क्रिस्टल के गठन, पेशी के उच्च पानी सामग्री की वजह से जमे हुए वर्गों की तैयारी के दौरान होता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले ठीक से उन्हें तरल नाइट्रोजन में विसर्जित करके मांसपेशियों के ऊतकों ठंड के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन है। अकेले तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर के साथ समस्या यह है कि यह ऊतक है, जो एक विसंवाहक के रूप में कार्य और ऊतकों को ठंडा करने को रोकता है के बगल में एक नाइट्रोजन गैस बाधा के गठन का कारण बनता है। इस "वाष्प कंबल" प्रभाव एक ne बचने के लिए,डब्ल्यू cryovial ऊतक सतह के चारों ओर तरल प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए डिजाइन किया गया था। इस शीशी की दीवार में 14 इनलेट छेद की कुल छिद्रण द्वारा हासिल की थी। बुलबुला गतिशीलता के अनुसार, छोटे बुलबुले और अवसर कम में तरल प्रवाह परिणामों की एक उच्च दर एक गैस बाधा के रूप में। तरल नाइट्रोजन इनलेट छेद के माध्यम से cryovial में प्रवाहित होती है तो ऊतक के आसपास प्रवाह वेग काफी तेजी से गैस बाधा को खत्म करने की है। पूर्व ठंडा isopentane का उपयोग कर मांसपेशियों के ऊतकों ठंड की विधि की तुलना में, इस प्रोटोकॉल सरल और अधिक कुशल है और एक throughput ढंग से मांसपेशियों को फ्रीज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि संस्थानों कि isopentane है, जो कमरे के तापमान पर अत्यंत ज्वलनशील है के लिए उपयोग की जरूरत नहीं है के लिए इष्टतम है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी को देखने के पोषण और प्रसंस्करण बिंदु से एक मांस उत्पादक जानवर की सबसे मूल्यवान घटक है। मांसपेशियों की वृद्धि की दक्षता और जिसके परिणामस्वरूप मांस की गुणवत्ता: मांस उद्योग में, दो विशेष रूप से महत्वपूर्ण पहलू हैं। पेशी के एक मुख्य घटक के रूप में, मांसपेशी फाइबर सीधे वृद्धि प्रदर्शन और जानवरों 1 में ताजा मांस गुणवत्ता से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, रेशे की कुल संख्या (TNF) और रेशों का क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र (CSAF) ज्यादातर मांसपेशियों और मांस गुणवत्ता निर्धारित; भी, फाइबर प्रकार संरचना (FTC) दृढ़ता से ताजा मांस गुणवत्ता 2 प्रभावित करता है। इसलिए, पशुओं में पेशी फाइबर विशेषताओं के हेरफेर एक बेहद कारगर तरीका कोर लाभप्रदता और खेतों 1 की प्रतिस्पर्धात्मकता को बढ़ाने के लिए है।
तिथि करने के लिए, कई आंतरिक और बाह्य कारकों पेशी फाइबर लक्षण हेरफेर करने के लिए पहचान की गई हैआईसीएस 1। इस हेरफेर ऐसे सूअरों 5 में मवेशी 3 में Myostatin जीन, भेड़ 4 में callipyge जीन, और RYR1 और IGF2 जीन के रूप में विशिष्ट जीन, के साथ जानवरों की लक्षित चयन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता। इसके अलावा, आहार नियंत्रण और विशिष्ट हार्मोन के साथ उपचार पेशी फाइबर विशेषताओं 6 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस प्रकार, एक दृष्टिकोण है कि आनुवंशिक और पोषण संबंधी कारकों को जोड़ती है दुबला मांस सामग्री और मांस की गुणवत्ता में सुधार करने में सक्षम हो सकता है। हालांकि, मांसपेशी फाइबर पर अध्ययन मांस उद्योग में सीमित हैं क्योंकि मांसपेशी फाइबर के संरचना की व्याख्या अभी भी एक चुनौती है।
स्नायु फाइबर गुण ऐसे मायोसिन एडेनोसाइन triphosphatase (ATPase के सक्रियण) परख के रूप में histochemical तरीकों का उपयोग कर पहचाने जाते हैं। इस विधि तथ्य यह है कि की पतली (6-8 सुक्ष्ममापी) जमे हुए वर्गों में स्थित एंजाइमों पर निर्भर करता हैमांसपेशी फाइबर रासायनिक कुछ उत्पादों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जा सकती है। हालांकि, मांसपेशियों के पानी की मात्रा सूअर, खरगोश, चूहों, और मनुष्यों में अधिक से अधिक 75% से, स्थिति (यानी, पीठ, पेट, या hindlimb) 7 की परवाह किए बिना है। जैसा कि पहले 8, 9 में वर्णित है, cryosections की तैयारी के दौरान – ठंड कलाकृतियों – मांसपेशियों में इस तरह के उच्च नमी की मात्रा एक सामान्य का सामना करना पड़ा समस्या होती है। ज्यादातर मामलों में, यह उचित रूप से, एक कसाईखाना उत्पादन लाइन में मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के हमारे अनुभव के अनुसार लगभग असंभव है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक उच्च throughput ढंग से cryosectioning के लिए मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन है। इस विधि का मुख्य आकर्षण एक नया cryovial कि तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड मांसपेशियों के ऊतकों के लिए बनाया गया है। वर्तमान कार्यप्रवाह समवर्ती ऊतक सुविधा कर सकते हैंठंड और एक उत्कृष्ट मांसपेशी cryosection के लिए प्रसंस्करण, एक स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बे और आसपास के ऊतकों में myofibers की तंग समानाधिकरण के साथ। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल क्योंकि तरल नाइट्रोजन ऊतकों के साथ मिश्रण नहीं है ऊतक विश्लेषण के लिए विकल्प की एक विस्तृत सरणी के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक नया, बहु छेद ठंड और मांसपेशियों के ऊतकों के संचय मांसपेशी समारोह के ऊतकीय आकलन करने के लिए के लिए cryovial का वर्णन। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है कि संशोधित बहु छेद cryovial में नमूना सीधे तरल नाइ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC) द्वारा समर्थित किया गया: 31,301,950 और 31,671,288।
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
