筋肉組織を直接液体窒素中に浸漬されたときにアーティファクトを凍結マルチホールクライオバイアルが不要
Summary
このプロトコルは、液体窒素に直接それらを沈めることにより、筋肉組織を凍結する手順を説明します。このプロトコルはまた、試料の窒素ガス際に液体窒素に接触組織表面の「ブランケット効果」を回避することができ、新たなクライオバイアルを強調しています。
Abstract
骨格筋生理学の研究は、適切にはっきりと見える細胞質コンパートメントでセクションを取得するために検体を処理する技術的な課題に直面しています。もう一つのハードルは、周囲の組織への筋線維のタイト同格です。組織固定し、パラフィン包埋のプロセスは、筋線維の収縮につながるので、凍結は切片のための筋肉組織を硬化させるのに最適な手段です。しかし、一般的に遭遇する問題、氷の結晶の形成は、理由は筋肉の高含水率の凍結切片の調製の間に発生します。ここで紹介するプロトコルは、最初に適切に液体窒素中でそれらを浸漬することにより、筋肉組織を凍結するための簡単で効率的な方法を説明します。単独で、液体窒素を使用しての問題は、次絶縁体として作用し、組織の冷却を阻害する、組織、窒素ガス障壁の形成を引き起こすことがあります。この「蒸気毛布」効果、NEを回避するために、Wクライオバイアルは、組織表面付近の液体の流れの速度を増大させるように設計しました。これは、バイアルの壁14個の入口穴の総数をパンチングすることによって達成されました。気泡力学によれば、より小さな気泡より少ないチャンスで液体流結果のより高い速度は、ガス障壁を形成します。液体窒素は、入口孔からクリオバイアルに流入すると、組織の周りの流速は、ガス障壁を排除するのに十分に高速です。予め冷却したイソペンタンを用いて、筋肉組織の凍結方法に比べて、このプロトコルは単純で、より効率的であり、スループット様式で筋肉を凍結するために使用することができます。さらに、この方法は、室温で非常に可燃性であるイソペンタン、へのアクセスを持っていない機関に最適です。
Introduction
骨格筋は、ビューの栄養と処理ポイントから肉を生産する動物の最も貴重なコンポーネントです。筋肉の成長の効率、そして得られた肉の品質：食肉業界では、二つの特に重要な側面があります。筋肉の主成分としては、筋線維は、成長のパフォーマンスと動物1新鮮な肉質に直接関連しています。例えば、繊維の合計数（TNF）及び繊維の断面積（CSAF）は主に筋肉量と肉の品質を決定します。また、ファイバ型の組成物（FTC）が強く、新鮮な肉質2に影響を与えます。したがって、動物における筋線維特性の操作は、農場1のコア収益性と競争力を高めるために非常に有効な方法です。
現在までに、いくつかの内因性および外因性の要因が筋線維を操作することが確認されているcharacteristICS 1。この操作は、牛3におけるミオスタチン遺伝子 、ヒツジ4 Callipyge遺伝子 、およびブタ5 RYR1及びIGF2遺伝子として、特定の遺伝子を有する動物の標的選択によって達成することができます。また、特定のホルモンとダイエットの制御および治療は、筋線維特性6において重要な役割を果たしています。このように、遺伝的および栄養要因を組み合わせたアプローチは、赤身の肉の量と肉の品質を向上させることができるかもしれません。筋線維の構造の解明は依然として難題であるしかし、筋線維の研究では、食肉産業に限定されています。
筋肉繊維特性は、ミオシンアデノシントリホスファターゼ（ATPアーゼ）アッセイなどの組織化学的方法を用いて同定されます。この方法は、酵素が薄い（6-8ミクロン）の凍結切片に位置しているという事実に依存しています筋線維は、化学的に特定の製品と反応させることができます。しかし、筋肉の水分含有量にかかわらず位置（ すなわち、バック、腹部、または後肢）7の、ブタ、ウサギ、マウス、およびヒトにおいて75％以上です。以前に8,9を説明するように、凍結切片の調製中-成果物を凍結-筋肉のような高水分含有量は一般的に遭遇する問題の原因となります。ほとんどの場合、適切に我々の経験によると、食肉処理場の生産ラインで筋肉組織を凍結することはほとんど不可能です。
ここで紹介するプロトコルは、ハイスループットな方法で凍結切片のための筋肉組織を凍結する私たちの研究室で使用されるシンプルかつ効率的な方法を説明します。この方法のハイライトは、液体窒素中でフラッシュ凍結筋肉組織のために設計された新しいクライオバイアルです。現在のワークフローは、同時に組織を容易にすることができますはっきりと見え、細胞質コンパートメントおよび周囲組織への筋線維の緊密な並置と、優れた筋肉凍結切片のために凍結して処理。液体窒素は、組織と混合しないので、また、このプロトコルは、組織分析のためのオプションの広い配列に適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、筋機能の組織学的評価を行うために筋肉組織を凍結保存するための新しい、マルチホールクライオバイアルを記述する。このプロトコルにおいて重要な変性ステップは、マルチホールクリオバイアルに試料を直接液体窒素中に浸漬することです。我々の知る限り、これは既存の凍結方法のうち、筋肉凍結切片のための優れた凍結サンプル（代表的な結果を参照）を取得する最も簡?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
31301950と31671288：このプロジェクトは、中国の国家自然科学基金（NSFC）によってサポートされていました。
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
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