A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب "تأثير بطانية" من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح الأنسجة من العينة.
Abstract
تواجه دراسات على فسيولوجيا العضلات والهيكل العظمي التحدي الفني للمعالجة بشكل مناسب العينات للحصول على المقاطع مع مقصورات حشوية واضحة للعيان. عقبة أخرى هي بدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. لأن عملية تثبيت الأنسجة وتضمينها البارافين يؤدي إلى انكماش ألياف العضلات التجميد هو وسيلة مثلى لتصلب الأنسجة العضلية لباجتزاء. ومع ذلك، تحدث مشكلة شيوعا التي تواجهها، وتشكيل بلورات الثلج، أثناء إعداد الأبواب المجمدة بسبب ارتفاع محتوى الماء من العضلات. بروتوكول المعروضة هنا يصف أولا طريقة بسيطة وفعالة لتجميد أنسجة العضلات بشكل صحيح عن طريق غمر لهم في النيتروجين السائل. المشكلة باستخدام النيتروجين السائل وحده هو أنه يؤدي إلى تشكيل حاجز غاز النيتروجين بجانب الأنسجة، الذي يعمل بمثابة عازل ويحول دون تبريد الأنسجة. لتجنب هذا "بطانية البخار" تأثير، وشمال شرقوقد تم تصميم cryovial ث لزيادة سرعة تدفق السائل حول سطح الأنسجة. وقد تحقق ذلك من خلال اللكم ما مجموعه 14 الثقوب مدخل في جدار القارورة. وفقا لديناميات فقاعة، وهو معدل أعلى من النتائج تدفق السائل في فقاعات أصغر وأقل فرص لتشكيل حاجز الغاز. عندما يتدفق النيتروجين السائل في cryovial من خلال الثقوب مدخل، وسرعة تدفق في جميع أنحاء الأنسجة سريعة بما يكفي للقضاء على حاجز الغاز. مقارنة لطريقة تجميد أنسجة العضلات باستخدام نظير البنتان قبل المبردة، وهذا البروتوكول هو أبسط وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها لتجميد العضلات بطريقة الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب هو الأمثل للمؤسسات التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى نظير البنتان، وهي قابلة للاشتعال للغاية في درجة حرارة الغرفة.
Introduction
الهيكل العظمي والعضلات هي العنصر الأكثر قيمة من الحيوانات المنتجة للحوم من الناحية التغذوية وتجهيز الرأي. في صناعة اللحوم، هناك جانبان خصوصا الحرجة: كفاءة نمو العضلات ونوعية اللحوم الناتجة عن ذلك. كعنصر رئيسي من العضلات، وألياف العضلات هي ذات الصلة مباشرة إلى أداء النمو وجودة اللحوم الطازجة في الحيوانات 1. على سبيل المثال، فإن العدد الإجمالي للألياف (TNF) ومنطقة مستعرضة للألياف (CSAF) تحديد معظمهم من كتلة العضلات وجودة اللحوم. أيضا، نوع من الألياف التركيب (FTC) تؤثر بقوة جودة اللحوم الطازجة 2. ولذلك، فإن التلاعب في خصائص الألياف العضلية في الحيوانات هي طريقة فعالة للغاية لزيادة الربحية الأساسية والقدرة التنافسية للمزارع 1.
حتى الآن، وقد تم تحديد العديد من العوامل الجوهرية وخارجي لمعالجة الألياف العضلية characteristICS 1. هذا التلاعب لا يمكن أن يتحقق من خلال اختيار المستهدفة من الحيوانات مع جينات معينة، مثل الجين Myostatin في الماشية 3، والجينات Callipyge في الأغنام 4، وRYR1 والجينات IGF2 الخنازير 5. أيضا، مراقبة النظام الغذائي والعلاجات مع هرمونات معينة تلعب دورا هاما في خصائص الألياف العضلية 6. وهكذا، وهو نهج يجمع بين العوامل الوراثية والغذائية قد تكون قادرة على تحسين محتوى اللحوم الخالية من الدهون وجودة اللحوم. ومع ذلك، تقتصر الدراسات على ألياف العضلات في صناعة اللحوم لاستجلاء هيكل من ألياف العضلات لا يزال يشكل تحديا.
يتم تحديد خصائص الألياف العضلية باستخدام أساليب النسيجية، مثل فحص الميوسين الأدينوزين فسفاتاز (أتباز). ويعتمد هذا الأسلوب على حقيقة أن الإنزيمات الموجودة في أقسام رقيقة (6-8 ميكرون) المجمدة منألياف العضلات يمكن أن يتفاعل كيميائيا مع بعض المنتجات. ومع ذلك، فإن المحتوى المائي للعضلات أكبر من 75٪ في الخنازير والأرانب والفئران والبشر، بغض النظر عن موقف (أي والظهر والبطن، أو hindlimb) 7. هذا نسبة عالية من الرطوبة في العضلات يسبب مشكلة تصادفها – تجميد التحف – أثناء إعداد cryosections، كما هو موضح سابقا 8 و 9. في معظم الحالات، فإنه يكاد يكون من المستحيل لتجميد الأنسجة العضلية بشكل مناسب في خط إنتاج المسلخ، وفقا لتجربتنا.
بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة بسيطة وفعالة المستخدمة في المختبر لدينا لتجميد الأنسجة العضلية لcryosectioning بطريقة عالية الإنتاجية. تسليط الضوء على هذا الأسلوب هو cryovial الجديد الذي تم تصميمه لأنسجة العضلات فلاش تجميد في النيتروجين السائل. سير العمل الحالي يمكن أن تسهل في الوقت نفسه الأنسجةتجميد وتصنيع لcryosection العضلات ممتازة، مع حجرة حشوية واضحة للعيان وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من الخيارات لتحليل الأنسجة لأن النيتروجين السائل لا يمتزج مع الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف الجديد، cryovial متعددة حفرة لتجميد وتخزين الأنسجة العضلية لإجراء عمليات تقييم النسيجية وظيفة العضلات. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن العينة في cryovial متعددة ثقب مغمورة مباشرة في النيتروجين السائل. على حد علمنا، وهذا هو أبسط وrapidest طريقة للحصول عل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC): 31301950 و31671288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
