En multi-hul kryohætteglas Eliminerer Frysning Artefakter når muskelvæv er direkte Nedsænket i flydende nitrogen
Summary
Denne protokol beskrives en procedure til at fryse muskelvæv ved at dyppe dem direkte i flydende nitrogen. Denne protokol fremhæver også en ny kryoglas, der kan undgå "tæppe effekt" af nitrogengas når flydende nitrogen i kontakt med vævsoverfladen af en prøve.
Abstract
Undersøgelser af skeletmuskulatur fysiologi står over for den tekniske udfordring af passende behandling af de prøver at opnå sektioner med klart synlige cytoplasmatiske rum. En anden hurdle er den stramme apposition af myofibre til de omkringliggende væv. Fordi processen med vævsfikseringen og paraffinindlejring fører til krympning af muskelfibre, frysning er en optimal middel til hærdning muskelvæv til sektionering. Men en almindeligt stødt problem, dannelsen af iskrystaller, forekommer under fremstillingen af frosne snit på grund af det høje indhold af muskel vand. Protokollen præsenteres her beskriver først en enkel og effektiv metode til korrekt frysning muskelvæv ved at nedsænke dem i flydende nitrogen. Problemet med anvendelse af flydende nitrogen alene er, at det forårsager dannelsen af en nitrogengas barriere siden af væv, der virker som en isolator og hæmmer kølingen af vævene. For at undgå denne "damp tæppe" effekt, en new kryohætteglas designet til at øge hastigheden af væskestrømning rundt vævsoverfladen. Dette blev opnået ved udstansning i alt 14 indløbshuller i væggen af hætteglasset. Ifølge boble dynamik, til en højere væskestrømningshastigheder resulterer i mindre bobler og færre chancer danne en gasbarriere. Når flydende nitrogen strømmer ind cryovialet gennem indgangshullerne, strømningshastigheden omkring vævet er hurtig nok til at eliminere gasbarriere. Sammenlignet med fremgangsmåden ifølge frysning muskelvæv under anvendelse forkølet isopentan, denne protokol er enklere og mere effektivt og kan anvendes til at fryse muskel i et gennemløb måde. Desuden er denne metode er optimal for institutioner, der ikke har adgang til isopentan, hvilket er yderst brandfarlig ved stuetemperatur.
Introduction
Skeletmuskler er den mest værdifulde komponent i en kødproducerende dyr fra et ernæringsmæssigt og forarbejdning synspunkt. I kødindustrien, er der to særligt kritiske aspekter: effektiviteten af muskelvækst og kvaliteten af den resulterende kød. Som en hovedbestanddel af musklen, muskelfibre er direkte relateret til vækst og friske kødkvalitet i dyr 1. For eksempel Samlet antal fibre (TNF) og Tværsnit af fibre (CSAF) hovedsagelig bestemme muskelmasse og kødkvalitet; også, Fiber type Sammensætning (FTC) kraftigt påvirker fersk kød kvalitet 2. Derfor, manipulation af muskel fiberegenskaber i dyr er en meget effektiv metode til at øge kernen rentabilitet og konkurrenceevne gårde 1.
Til dato har flere interne og eksterne faktorer blevet identificeret til at manipulere muskelfiber characteristics 1. Denne manipulation kan opnås ved målrettet udvælgelse af dyr med specifikke gener, såsom myostatingenet hos kvæg 3, den Callipyge genet hos får 4, og RYR1 og IGF2-generne i svin 5. Også, kost kontrol og behandlinger med bestemte hormoner spiller en vigtig rolle i muskel fiberegenskaber 6. Således kan en tilgang, der kombinerer genetiske og ernæringsmæssige faktorer kunne forbedre indholdet af magert kød og kødkvalitet. Imidlertid er undersøgelser af muskelfibre begrænset i kødindustrien fordi opklaringen af strukturen af muskelfibre stadig er en udfordring.
Muskel fiberegenskaber identificeres ved anvendelse histokemiske metoder, såsom myosin adenosintriphosphatase (ATPase) assay. Denne metode beror på, at enzymer ligger i tynde (6-8 um) frosne sektioner afmuskelfibre kemisk kan reagere med visse produkter. Men indholdet af muskler vand er større end 75% hos grise, kaniner, mus og mennesker, uanset placeringen (dvs. ryggen, maven, eller bagben) 7. Sådan højt vandindhold i musklerne forårsager en almindeligt forekommende problem – frysning artefakter – under fremstillingen af kryosnit, som tidligere beskrevet 8, 9. I de fleste tilfælde er det næsten umuligt at passende fryse muskelvæv på et slagteri produktionslinje, ifølge vores erfaring.
Protokollen præsenteres her beskriver en enkel og effektiv metode, der anvendes i vores laboratorium til at fryse muskelvæv for Fremstilling af frysesnit i en high-throughput måde. Højdepunktet i denne metode er en ny kryoglas, der er designet til flash-frysning muskelvæv i flydende nitrogen. Den nuværende arbejdsgang kan samtidigt lette vævfrysning og forarbejdning for en fremragende muskel kryosektion, med en klart synlig compartment og den stramme apposition af myofibre til det omgivende væv. Desuden kan denne protokol anvendes til en bred vifte af muligheder for vævsanalyse fordi flydende nitrogen ikke blandes med væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en ny, multi-hul kryoglas til nedfrysning og opbevaring muskelvæv til at udføre histologiske vurderinger af muskelfunktion. Den kritiske modificerede trin i denne protokol er, at prøven i flerhuls kryohætteglas er direkte nedsænket i flydende nitrogen. Så vidt vi ved, er dette den enkleste og rapidest måde at opnå gode frosne prøver for muskel Fremstilling af frysesnit blandt de eksisterende indefrysning metoder (se de repræsentative resultater).
Den tekniske udfor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 og 31.671.288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
