हम दो या तीन आयामी embryoid निकायों पैदा करने के लिए murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए एक तकनीक का वर्णन। हम तो रेटिनोइक एसिड, और कैसे द्वारा embryoid शरीर की कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव प्रेरित करने के लिए कैसे पूर्वज सेल मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoblotting द्वारा भेदभाव के अपने राज्य का विश्लेषण करने के लिए समझाने।
माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) ब्लास्टोसिस्ट (आमतौर पर दिन E3.5 पर) के भीतर बड़े पैमाने पर से अलग, जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) के अभाव में, ESCs तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं में डिफ़ॉल्ट रूप से अंतर। वे प्रारंभिक चरण भ्रूण को इसकी समानता के कारण एक तीन आयामी (3 डी) में जमा कर रखे जा सकती है, गोलाकार कुल embryoid शरीर (ईबी) करार दिया। ईबीएस, फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है जहां वे दो आयामी (2 डी) एक्सटेंशन बढ़ रही द्वारा विस्तार, या 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स, जहां वे spheroids के रूप में बढ़ जारी रखने, और तीन रोगाणु परतों में भेद में प्रत्यारोपित: endodermal, mesodermal, और बहिर्जनस्तरीय। 3 डी कोलेजन संस्कृति 2 डी ईबीएस की तुलना में अधिक बारीकी से इन विवो वातावरण की नकल करता। 2 डी ईबी संस्कृति इम्यूनोफ्लोरेसेंस और भेदभाव को ट्रैक करने के immunoblotting द्वारा विश्लेषण की सुविधा। हम एक दो कदम तंत्रिका वैशिष्ट्य का विकास किया हैtion प्रोटोकॉल। पहले चरण में, ईबीएस फांसी ड्रॉप तकनीक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, और, एक साथ, रेटिनोइक एसिड (आरए) के संपर्क से अलग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। दूसरे चरण में, आरए के अभाव में एक 2 डी या 3 डी प्रारूप में तंत्रिका भेदभाव आय।
ESCs ब्लास्टोसिस्ट आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उत्पन्न होते हैं। इन कोशिकाओं को, pluripotent हैं यानी वे मूल के जीव के किसी भी प्रकार की कोशिका में अंतर करने के लिए क्षमता है। ESC इन विट्रो भेदभाव विकास के रास्ते और तंत्र की जांच के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में व्यापक ब्याज की है। यह सेल और ऊतक शिथिलता के सुधार के लिए नई चिकित्सा दृष्टिकोणों को परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। ईबीएस जल्दी embryogenesis दौरान सेल भेदभाव के कई पहलुओं पुनरावृत्ति। विशेष रूप से, ईबीएस जब भ्रूण घातकता को यह मुश्किल भ्रूण दोष 1, 2 के सेलुलर आधार निर्धारित करने में आता है इस्तेमाल किया जा सकता। ईबीएस फांसी ड्रॉप या तरल निलंबन तकनीक 3 से या तो गठित किया जा सकता। पूर्व का लाभ लगातार आकार और घनत्व के ईबीएस उत्पन्न करने के लिए, इस प्रकार प्रयोगात्मक reproducibility को सुविधाजनक बनाने की क्षमता है।
<p cलड़की = "jove_content"> बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन प्रोटीन के साथ बातचीत गतिशीलता और पक्षपाती कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता। 2 डी संस्कृति प्रणाली में, फ़ाइब्रोनेक्टिन अक्सर सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए आवेदन किया है। फ़ाइब्रोनेक्टिन एक आधारी पटल घटक heterodimers 4 इंटीग्रिन कोशिका-सतह के 10 प्रकार के द्वारा मान्यता प्राप्त है।आरए विटामिन ए कि तंत्रिका भेदभाव 5, 6 को प्रेरित करता है की एक छोटी lipophilic मेटाबोलाइट है। आरए की उच्च सांद्रता तंत्रिका जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने और ईबी गठन 7, 8 के दौरान mesodermal जीन अभिव्यक्ति represses। आरए एक ऑक्सीकरण विटामिन या तो शराब या रेटिनोल डिहाइड्रोजनेज, retinaldehyde डिहाइड्रोजनेज 9 से अंतिम उत्पाद के लिए retinaldehyde ऑक्सीकरण के बाद से retinaldehyde करने द्वारा निर्मित है। तंत्रिका भेदभाव कोशिका द्रव्य से आरए के परिवहन की आवश्यकता है सेलुलर आरए बाध्यकारी प्रोटीन 2 (CRABP2) द्वारा नाभिक के लिए। नाभिक में, आरए अपने सजातीय रिसेप्टर एक RAR-RXR heterodimer के 10 से मिलकर जटिल को बांधता है। यह ट्रांस्क्रिप्शनल सह activators की भर्ती, और प्रतिलेखन 9, 11 की दीक्षा का परिणाम है। इसके अलावा, आरए फॉस्फोरिलेटेड (सक्रिय) SMAD1 की गिरावट को बढ़ावा देता है, इस प्रकार बीएमपी और SMAD संकेत 12 antagonizing। इन गतिविधियों के अलावा, आरए Pax6 अभिव्यक्ति, एक प्रतिलेखन कारक तंत्रिका भेदभाव 13 का समर्थन करता है कि बढ़ जाती है। आरए संकेतन sirtuin -1 (SIRT1), एक परमाणु निकोटिनामाइड एडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NAD +) द्वारा ठीक किया जाता है – निर्भर एंजाइम है कि CRABP2 deacetylates, नाभिक के लिए अपने अनुवादन के साथ दखल दे, और इसलिए आरए RAR-RXR heterodimer के 14, 15 के लिए बाध्य के साथ, 16।
e_content "> यहाँ वर्णित आरए इलाज ईबी प्रोटोकॉल को डिजाइन करने में हमारा लक्ष्य आदेश संकेत दे रास्ते कि neuronal अग्रदूत कोशिकाओं में ESC भेदभाव को विनियमित की इन विट्रो विश्लेषण की सुविधा में तंत्रिका भेदभाव का अनुकूलन है। इस प्रोटोकॉल के लाभों में से एक की सुविधा है इम्यूनोफ्लोरेसेंस। 3 डी ईबीएस द्वारा कोशिकाओं के कार्य का विश्लेषण अच्छी तरह से एंटीबॉडी द्वारा प्रवेश और दौरान तंत्रिका भेदभाव कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा immunolabeling और कोशिकाओं की इमेजिंग की सुविधा विशिष्ट समय बिंदुओं पर एक 2 डी monolayer में छवि। ईबी पृथक्करण के लिए मुश्किल हैं नहीं कर रहे हैं।इस प्रोटोकॉल में हम murine ESCs के तंत्रिका भेदभाव का अध्ययन करने के एक अपेक्षाकृत सरल और सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं। पिछले प्रोटोकॉल में, आरए दिन 2 या ईबी फांसी ड्रॉप 8 में से 4 दिन में या निलंबन संस्क…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन एएच को एनआईएच अनुदान R01 HL119984 द्वारा समर्थित किया गया
Materials | |||
MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
Cell strainer | Corning | 352360 | |
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
PBS | Gibco | 10010049 | |
Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |