Summary
We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.
Abstract
Muis embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de binnenste massa van de blastocyst (gewoonlijk op dag E3.5), kan worden gebruikt als in vitro modelsysteem voor het bestuderen vroege embryonale ontwikkeling. Bij afwezigheid van leukemie remmende factor (LIF), SER differentiëren standaard tot neurale voorlopercellen. Ze kunnen worden vergaard in een driedimensionale (3D) sferisch aggregaat aangeduid embryoiden lichaam (EB) vanwege zijn gelijkenis met het vroege stadium embryo. EBS kunnen worden gezaaid op fibronectine beklede dekglaasjes, waar ze uitbreiden door kweken tweedimensionale (2D) extensies of geïmplanteerd in 3D collageenmatrices waar ze blijven groeien als sferoïden en differentiëren tot drie kiembladen: endodermale, mesodermale en ectodermale. De 3D collageen cultuur bootst de in vivo omgeving beter dan de 2D-EBS. De 2D EB cultuur vergemakkelijkt de analyse van immunofluorescentie en immunoblotting om differentiatie te volgen. We hebben een twee-staps neurale differentia ontwikkeldtie protocol. In de eerste stap worden EB opgewekt door de hangende druppel techniek en tegelijkertijd worden geïnduceerd om te differentiëren door blootstelling aan retinoïnezuur (RA). In de tweede stap neurale differentiatie verloopt in een 2D- of 3D-formaat bij afwezigheid van RA.
Introduction
SER afkomstig van de blastocyst binnenste celmassa. Deze cellen zijn pluripotent, dat wil zeggen zij hebben het vermogen om te differentiëren in elk celtype van het organisme van herkomst. ESC in vitro differentiatie is van groot belang als een experimenteel systeem voor het onderzoeken van ontwikkelingstrajecten en mechanismen. Het biedt een krachtige en flexibele modelsysteem om nieuwe therapeutische benaderingen voor de correctie van cellen en weefsels dysfunctie te testen. EBS recapituleren vele aspecten van celdifferentiatie tijdens de vroege embryogenese. In het bijzonder kan EBS worden gebruikt wanneer embryonische letaliteit bemoeilijkt de cellulaire basis van de embryonale gebreken 1, 2 bepalen. EBS kan hetzij worden gevormd door de hangende druppel of vloeibare suspensietechnieken 3. Het voordeel van de eerste is de mogelijkheid om EB consistente grootte en dichtheid te genereren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid vergemakkelijkt.
4.
RA is een kleine lipofiele metaboliet van vitamine A die neurale differentiatie 5, 6 induceert. Hoge concentraties van RA bevorderen neurale genexpressie en onderdrukt mesodermale genexpressie tijdens EB vorming 7, 8. RA wordt door vitamine A oxidatie tot retinaldehyde door een alcohol of retinol dehydrogenase, gevolgd door retinaldehyde oxidatie tot het uiteindelijke product door retinaldehyde dehydrogenase 9. Neurale differentiatie vereist transport van RA uit het cytoplasma de kern van cellulaire RA-bindend eiwit 2 (CRABP2). In de kern, RA bindt aan de verwante receptor complex van een RAR-RXR heterodimeer 10. Dit leidt tot rekrutering van transcriptionele co-activatoren, en initiatie van transcriptie 9, 11. Bovendien RA bevordert de afbraak van gefosforyleerd (actieve) Smad1, dus tegenwerken van BMP en Smad signalering 12. Naast deze activiteiten RA verhoogt Pax6 expressie, een transcriptiefactor die neuronale differentiatie 13 ondersteunt. RA signalering wordt gemoduleerd door sirtuine-1 (Sirt1), een nucleair nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) - afhankelijk enzym dat CRABP2 deacetylates interfereren met zijn translocatie naar de kern, en dus met RA binding aan de RAR-RXR heterodimeer 14, 15, 16.
e_content "> Ons doel bij het ontwerpen van de RA-behandelde EB protocol hier beschreven neurale differentiatie optimaliseren om in vitro analyse van de signaleringspaden die ESC differentiatie reguleren in neuronale voorlopercellen te vergemakkelijken. Een voordeel van dit protocol is vergemakkelijking van de analyse van celfunctie door immunofluorescentie. 3D EB's niet goed gepenetreerd door antilichamen en moeilijk beeld. EB dissociatie in een 2D monolaag op specifieke tijdstippen tijdens neurale differentiatie bevordert immunokleuring en beeldvorming van de cellen met confocale microscopie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur van de muis embryonale fibroblasten (MEF)
- Bereiden MEF medium, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM hoge glucose) aangevuld met 15% foetaal runderserum (FBS).
- Coat 100 mm celcultuurschalen met 0,5% gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Count MEF met behulp van een cytometer. Verwijder de gelatineoplossing en giet onmiddellijk MEF medium voorverwarmd tot 37 ° C. Snel ontdooien flesjes mitomycine-C behandelde MEFs in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min, vervolgens zaad 2,8 x 10 6 MEFs per 100 mm met gelatine gecoate schaal. Pas aantal cellen dienovereenkomstig bij gebruik van gerechten uit andere maten. Incubeer MEF overnacht bij 37 ° C, 5% CO2.
- Verander het medium op de volgende dag. Cultuur voor 2-3 dagen tot de MEF laag confluent.
2. Mouse ESC Cultuur
- Bereid ESC medium, Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), aangevuld met 15% FBS en 103 U / ml leukemie remmende factor (LIF), 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 55 mM 2-mercaptoethanol, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), gentamicine (200 ug / ml) en 0,2% mycoplasma antibioticum.
- Verwijderen MEF medium van de plaat bereid in stap 1 en vervangen 37 ° C voorverwarmd medium ESC.
- Ontdooien een ESC flesje en zaadcellen bovenop de MEF laag. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 totdat SER confluentie bereiken.
- Bereid nieuwe celcultuur platen met een confluente monolaag van MEFs. Om doorgang van de SER, eenmaal met PBS en los met 0,25% trypsine / EDTA gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. Stop de behandeling met trypsine door toevoegen van verse IMDM met 15% FBS aan de cellen los, breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en centrifugeer bij 160 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer SER vers IMDM en een vijfde passage van de cellen voor elke nieuwe MEF-gecoate schaal; Incubeer totdat de cellenbereiken samenvloeiing (meestal 4-5 dagen).
3. Zuig MEFs en cultuur SER op gelatine-gecoate platen
- Zodra ECSS confluentie bereikten, loshaken en MEFs met 0,25% trypsine / EDTA zoals in stap 2.4, resuspendeer de cellen in vers IMDM transfer naar een niet-hechtende bacteriologische petrischaal en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Zorg dragen SER en MEF-bevattend medium in nieuw gelatine beklede platen met behulp van een 5 ml pipet vermijden herhaald pipetteren. De cellen die nog in de petrischaaltjes zijn MEF, omdat SER niet voldoen.
- Passage de SER om de 3-4 dagen. Minder vaak passage kan ESC pluripotentie verminderen. Neem niet meer dan 60% samenvloeiing, want het onderscheid kan worden bevoordeeld.
- Herhaal stap 3,2-3,3 drie keer of meer, indien nodig, totdat MEF's niet meer aantoonbaar door een celcultuur microscoop, met behulp van een 20X objectief, om ervoor te zorgen MEF niet aanwezig zijn.
- Controleer ESC pluripotentie door het controleren van ESCkweek of de cellen gevormd dichte kolonies met typische ESC polygonale morfologie (figuur 1A). Testcel stemness door kwantitatieve reverse transcriptase polymerase kettingreactie (qRT-PCR) 17, 17 immunoblotting of immunofluorescentie van de kern pluripotentie transcriptiefactoren 17 (figuur 2).
4. EB Formation
- Bereid all-trans-RA voorraadoplossing van 10 mM in DMSO en aliquot in 1,5 ml microfuge-licht beschermd buizen. De oplossing is stabiel bij -80 ° C gedurende maximaal twee weken. Beschermen tegen licht.
- Trypsinize SER zoals in stap 2.4; replate in vers IMDM zonder LIF als een eencellige suspensie.
- Aantal cellen met behulp van een hemocytometer, en stelt een 5 x 10 5 cellen / ml suspensie in IMDM met 0,5 uM RA.
- Plaat 100 20-pl-druppels per 100 mm petrischaal met een 8-kanaals pipet en 200 pi tips, invertde gerechten, en vul de omgekeerde deksel met PBS tot opknoping vallen van uitdroging te voorkomen. Protect-RA met cultuur media tegen licht.
- Cultuur EBS in hangende druppels bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 dagen.
5. 2D EB Cultuur
- Coat 12 mm ronde glazen dekglaasjes met 30 ug / ml fibronectine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats elke dekglaasje in een putje van een 24-wells plaat en voeg 1 ml IMDM per putje.
- Oogst 3 dagen gekweekt opknoping druppel EB's een voor een met 200 pi pipetpunten en zaden ze op met fibronectine gecoate dekglaasjes, 20 EBS per putje, met dezelfde pipetpunten.
LET OP: 3-daagse EBS zijn de voorkeur boven 4-daagse EBS, omdat ze beter om de dekglaasjes hechten. - Doorgaan cultuur met IMDM-15% FBS zonder LIF. Vervang medium om de 3-4 dagen. Verzamel de gebruikte medium voor eiwituitscheiding analyse nodig.
6. Detectie van Uitgescheiden Proteïnes
- Overdracht 500 pi van EB medium tot 10 kDa cutoff centrifugale filters spinnen bij 20.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C.
- Onderzoek de overige in de centrifugale filters elke 15-20 min om overdadige verrijking te voorkomen dat medium. Centrifugeren stopt wanneer het volume van het resterende medium is gedaald tot 25 pl.
- Verzamel de resterende geconcentreerde medium na het omkeren van het filter en centrifugeren bij 160 x g bij 4 ° C, volgens de instructies van de fabrikant.
- Detecteren de uitgescheiden eiwitten door immunoblotting met antilichamen 17.
7. 3D EB Cultuur
- Verzamel de EBS 4 dagen gekweekt in opknoping druppels zoals beschreven in stap 5.2 en plaats ze in 1,5 ml centrifugebuizen (30 EB per buis).
- Bereid collageen gel oplossing volgens de instructies van de 3D collageen cultuur kit (zie ook Materiaal / Equipment Table). Verdunde geschikte volumes collageenoplossing en 5x DMEM (kit component); voeg de neutralization oplossing (een kit component) en meng goed onmiddellijk en bewaar op ijs.
- Pipet een geschikt volume van gekoelde collageenoplossing in de buis 1,5 ml bevattende de EBS, en voorzichtig te dragen aan de putjes van een 6-wells plaat met een 1 ml pipet tip. Vermijd het maken van bubbels.
- Geeft de plaat over te brengen naar 37 ° C, 5% CO2, gedurende 60 min collageen polymerisatie te initiëren.
- Overlay de EB-bevattende plaat met IMDM.
- Veranderen medium elke 3-4 dagen.
8. EB Dissociatie
- Verzamel de dag 4 EBS (van stap 4) één voor één, met 200 pi pipetpunten en overbrengen naar een niet-hechtende bacteriologische petrischaal met IMDM met 15% FBS; kweken bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende nog 4 dagen. Controleer de EBS twee keer per dag om ervoor te zorgen dat ze niet hechten aan de bodem; schud de schotel EB bevestiging aan de bodem te voorkomen.
- Centrifugeer de EB bij 185 xg gedurende 5 minuten bijRT in een benchtop centrifuge.
- Verwijder het supernatants. De pellet mag niet meer dan 100 pl in elke buis.
- Naar gepelleteerde EBS 1 ml 0,25% Type I collagenase per buis, aangevuld met 20% FBS in PBS.
- Incubeer de EB-collagenase mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2, het voorzichtig pipetteren elke 20 minuten, onder toepassing van 1 ml pipet tips.
- Was de cellen voorzichtig 3x met PBS. Als cel aggregaten aanwezig zijn, gebruikt een cel zeef met een 100 urn gaas te verwijderen.
- Replate de cellen op een met gelatine beklede 60 mm schalen in IMDM. Incubeer daarna bij 37 ° C, 5% CO2.
9. Transfectie van Gescheiden EBS
- Voor qRT-PCR en immunoblotting, laag een 6-wells plaat met 0,5% gelatine.
- Voor immunofluorescentie, laag dekglaasjes met 30 ug / ml fibronectine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats elke dekglaasje in een putje van een 24-well plaat. IMDM toevoegen.
- Seed 4.75 x 10 5 of 1 x 10 5
- Groeien de cellen tot 70% confluentie voor transfectie.
- Transfecteren cellen door een liposomale lipide stamcel optimaal reagens 17 (zie Materialen / Apparatuur Table), volgens de instructies van de fabrikant.
NB: Het reagens we gebruikten typisch een transfectie-efficiëntie van 50% bereikt (zie Representatieve resultaten). - Analyseer de monsters met qRT-PCR of door immunoblotting 17 2 of 3 dagen na transfectie, respectievelijk.
10. Analyse van EB Differentiatie Immunofluorescentie
- Wassen EBS 2D of 3D gedissocieerd EBS met PBS en bevestig met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen 3x met PBS te verwijderen zwevende celresten.
OPMERKING: Paraformaldehyde is een huid- en oogirritatie; gebruik voorzichtigheid bij het hanteren van het. Voeg 1% Triton X-100 in PBS aan de cellen voor 20 minuten permeabilize bij KT, daarna wassen 3x met PBS. - Verwijder PBS en geblokkeerd met 5% BSA in PBS gedurende 30 min.
- Bereid primaire antilichaam verdunning in 1% BSA / PBS aangevuld met 0,03% Triton X-100. Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C, daarna wassen cellen 3x met PBS.
- Breng secundair antilichaam in PBS volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, daarna wassen cellen 3x met PBS.
- Mount dekglaasjes op glasplaatjes met een anti-fade medium voor optische microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog, en SOX2 de kern transcriptiefactoren die ESC zelfvernieuwing en pluripotentie verlenen. We pasten bovenstaande protocol bij de neurale differentiatie van SER vergelijken van wild type en van een stam van genetisch gemodificeerde muizen waarbij Syx, een gen dat codeert voor het RhoA specifieke exchange factor Syx wordt verstoord. We hadden Syx betrokken bij angiogenese 18. Wij merkten verschillen in het gedrag van EBS geaggregeerde van Syx + / + en Syx - / - SER's, en ging om te testen of de neurale differentiatie van Syx - / - SER's is sneller dan die van hun Syx + / + tegenhangers.
De begintoestand van Syx vergelijken + / + en Syx - / - SER, we gekwantificeerd in elk genotype de abundanties van Oct4, Nanog, en SOX2, de kern transcriptiefactoren thoed verlenen ESC zelf-vernieuwing en pluripotentie. Zoals beschreven in stap 10 van het protocol werden immunologisch SER door Oct4, Sox2 en Nanog antilichamen. De abundanties van de 3 transcriptiefactoren in Syx + / + en Syx - / - SER's waren vergelijkbaar, zoals bepaald met immunofluorescentie (Figuur 2) en immunoblotten 17 (figuur 2).
EBS geïmplanteerd in een 3D collageenmatrix (Figuur 1B) start kiemen cellulaire extensies die zichtbaar is op een celkweek microscoop met een 10x objectief, 2 dagen na implantatie. Op dag 6, tussen 5-10 spruiten van 200 pm of minder kan normaal worden waargenomen in Syx + / + EBS, terwijl in Syx - / - EB, 30-50 spruiten worden vaak waargenomen, waarvan de meeste langer dan 200 urn (Figuur 1C).
Syx uitgebreid - / - dan van Syx + / + 2D EBS (Figuur 3A). / - - Om de snelheid van de neurale differentiatie van de cellen die zich uitstrekte van de Syx + / + en Syx vergelijken EBS, we immunolabeled ze na 6 dagen van 2D-cultuur door de neurale stamcellen marker nestin, een intermediair filament regulerend eiwit 19. Nestin overvloed aanzienlijk hoger was in cellen die zich vanaf Syx - / - EBS (Figuur 3B). Vervolgens vergeleken we de overvloed aan nestin en tubuline β3 (Tubβ3), een axonale cytoskelet eiwit 20, in de cellen losgemaakt van 13-daagse 2D EBS. Beide eiwitten waren overvloedig in cellen losgemaakt van Syx - / - EBS dan hun Syx + / + tegenhangers (Figuur 3C). We soortgelijke resultaten verkregen door kwantificering van immunoblosla van dezelfde eiwitten 17.
Figuur 4 toont getransfecteerd door constitutief groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd is actief RhoA (RhoA-Q63L) met een stamcel optimale transfectiereagens (zie Materialen / Apparatuur tabel).
Figuur 1: Spruit Emergence van Syx + / + en Syx - / - EBS in 3D cultuur. (A) Syx + / + en Syx - / - SER groeide geclusterd kolonies vóór de inductie van neuronale differentiatie. (B en C) beelden van EBS gevormd opknoping druppels met 0,5 uM RA, en vervolgens in een 3D collageenmatrix ingebracht zonder RA, zoals beschreven in stap 7,1-7,4. Beelden werden vastgelegd op dag 6 van de aangegeven doelstellingen (Scale b ars = 100 um in A en C, 200 urn B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Aanwezigheid van Pluripotentie Core transcriptiefactoren. Representatieve beelden die de abundanties van de aangegeven kern pluripotentie markers in Syx + / + en Syx - / - SER (schaalbalk = 50 pm). Zie Yang et al. 17 voor details over de immunokleuring methode (schaalbalk = 50 urn; DAPI, 2- (4-amidinofenyl) -1H-indool-6-carboxamidine). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
guur 3" src = "/ files / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Figuur 3: Visualisatie van neurale differentiatie merkers in EB cellen. (A) Fase afbeeldingen 2D EB randen aantoont dat cellen sneller van Syx geëxpandeerde - / - dan van Syx + / + EBS (schaalbalk = 200 pm). (B) immunofluorescentie beelden die de neurale differentiatie marker nestine was overvloedig in cellen uitbreiding van 6 dagen 2D Syx - / - EBS dan uit hun Syx + / + tegenhangers (schaalbalk = 50 pm). (C) immunofluorescentie beelden die de neurale differentiatie merkers nestine en Tubβ3 waren overvloedig in cellen gedissocieerd van 13 dagen 3D Syx - / - EBS dan uit hun Syx + / + tegenhangers (schaalbalk = 50 pm). Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Visualisatie van de efficiëntie van de transfectie reagens. Drie replicaten van immunofluorescentie beelden die getransfecteerd door SER constitutief actieve RhoA gefuseerd aan GFP aan de transfectie-efficiëntie van het reagens dat in stap 9.5 van het protocol (schaalbalk = 50 pm) tonen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol presenteren we een betrekkelijk eenvoudige en toegankelijke wijze neurale differentiatie van muis SER bestuderen. In eerdere protocollen werd RA toegevoegd aan het medium op dag 2 en dag 4 van de EB hangende-druppel 8 of suspensiecultuur 7, respectievelijk, of onmiddellijk na de EB opknoping druppel 21 aggregatie. In het protocol we bedacht, werd RA eerder toegevoegd. Ondanks de eerdere invoering van RA EBS gevormd door suspensiekweek, dit protocol verkregen hogere expressie van neurale differentiatie 8 markers.
Hier hebben we de voorkeur het toepassen van RA en het induceren van neurale differentiatie aan het begin van de hangende druppel cultuur. Deze modificatie maakt gelijk RA blootstelling aan de SER als ze nog in een enkele celsuspensie vóór EB aggregatie. Als RA toegevoegd aan EBS geaggregeerde cellen in de inwendige massa EB waarschijnlijk voel een lager RA concentratidan op cellen in de buitenste laag. Toepassing van RA bij aanvang van EB aggregatie is ook voordelig omdat het onderdrukt mesodermale en endodermale kiemlaag ontwikkeling vóór neurale differentiatie van de ectodermale laag 7, 8. We hebben bevestigd dat behandeling van RA gepromoot neurale differentiatie door het onderzoeken van de overvloed van bijna 10 markers 17.
Er zijn drie belangrijke overwegingen bij dit protocol. De eerste is de maximale afname van MEF feeder-cellen een hoge zuiverheid ESC populatie bereiken. De tweede is de lichtgevoeligheid van RA: de voorraadoplossing en de hangende druppels moet worden beschermd tegen licht na RA toepassing. RA voorraadoplossing stabiel slechts twee weken, waarna een verse oplossing moeten worden bereid. De derde overweging is de RA concentratie. In onze proefprojecten, vonden we dat bij een concentratie van 10 uM RA vertraagde celgroei en produceerd kleinere EBS vergelijking met lagere concentraties mogelijk omdat RA kan apoptose veroorzaken bij hoge conncentrations 22, 23, 24. We zagen dat RA een concentratie van 0,5 pM produceerde een groter aantal goed gevormde EB dan bij ofwel 25 hogere of lagere concentraties, en dat de EBS bereikte een gemiddelde diameter van ongeveer 200 urn. EB groter de veldgrootte overschrijden van een 10X objectief en waren bijgevolg moeilijker te beeld. Daarom hebben we gekozen voor 0,5 uM zo optimaal RA concentratie.
Analyse door middel van immunofluorescentie van 3D EBS is problematisch omdat ze te broos voor bevroren coupes. Verder vonden we dat bevroren EB secties niet goed vasthouden aan ongecoate glasplaatjes elektrostatisch behandeld. Voorbereiding van de 2D-EB cultuur vereist aggregatie van extra opknoping druppels, omdat sommige EBS niet goed hechten aan de ondergrond. EB dissociation, die relatief langzaam kan worden versneld door pipetteren de EBS en neer in een 1,5 ml microfugebuis tijdens de incubatie met collagenase.
Neuraal gedifferentieerde SER's kunnen worden gebruikt om beschadigde endogene cellen, bijvoorbeeld dopaminerge neuronen verloren in de substantia nigra in de hersenen van patiënten die lijden aan de ziekte van 26 Parkinson te vervangen. Hoewel de huidige technieken van menselijke ESC differentiatie niet EB formatie (ibid.) Vereisen, EBS nog een nuttig instrument voor gedetailleerde analyse van neurale differentiatie op moleculair niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende of financiële belangen
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidie R01 HL119984 AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
