Analyse av retinsyre-indusert Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i to og tre-dimensjonale embryoidlegemer

Summary

Vi beskriver en teknikk for anvendelse av muse embryonale stamceller for generering av to eller tredimensjonale embryoidlegemene. Vi forklarer hvordan å indusere differensiering av nevrale embryoid kroppscellene hos retinsyre, og hvordan å analysere deres tilstand av differensiering av stamceller markør immunfluorescens og immunblotting.

Abstract

Muse embryonale stamceller (ESCS) er isolert fra den indre massen av blastocysten (typisk dag E3.5), kan bli anvendt som in vitro modellsystem for å studere tidlige embryoutvikling. I fravær av leukemi-inhiberende faktor (LIF), ESCs differensiere som standard i neurale forløperceller. De kan bli samlet inn i en tre-dimensjonal (3D) sfærisk aggregat betegnet embryoid legeme (EB) på grunn av dets likhet til tidlig stadium embryo. EBS kan podes på fibronectin-belagte dekkglass, hvor de utvider seg ved økende todimensjonale (2D) utvidelser eller implantert i 3D kollagenmatrikser hvor de fortsetter å vokse som sfæroider, og skille ut de tre kimlag: endodermal, mesodermal, og ectodermal. 3D-kollagen kulturen etterligner in vivo miljøet tettere enn 2D EBS. 2D EB kultur muliggjør analyse av immunfluorescens og immunblotting for å spore differensiering. Vi har utviklet en to-trinns nevrale differentiasjon protokoll. I det første trinn blir EBS generert av den hengende dråpe-teknikk, og, samtidig, blir indusert til å differensiere ved hjelp av eksponering for retinsyre (RA). I det andre trinnet, neural differensiering forløper i et 2D eller 3D-format i fravær av RA.

Introduction

ESCs stammer fra blastocyst indre cellemasse. Disse cellene er pluripotent, dvs. de har kapasitet til å differensiere i en celle type organisme opprinnelsesland. ESC in vitro differensiering er av bred interesse som et eksperimentelt system for å undersøke utviklingsveier og mekanismer. Det har en kraftig og fleksibel modellsystem for å teste nye terapeutiske tilnærminger for korrigering av celle og vev dysfunksjon. EBS rekapitulere mange aspekter av celledifferensiering i tidlig embryogenese. Spesielt kan EBS brukes når embryoniske letalitet gjør det vanskelig å bestemme den cellulære basis av de embryoniske defekter ^{1, 2.} EBS kan dannes enten ved den hengende dråpe eller flytende suspensjonsteknikker ^3. Fordelen med det tidligere er evnen til å generere EBS med jevn størrelse og tetthet og letter således eksperimentelle reproduserbarhet.

<p class = "jove_content"> Interaksjon med ekstracellulære matriks (ECM) adhesjonsproteiner kan påvirke motilitet og overlevelse av adherente celler. I det 2D-kultursystemet, er fibronektin ofte brukt for å øke celle adhesjon til substratet. Fibronektin er et basal lamina komponent som gjenkjennes av 10 typer av celleoverflate-integrin-heterodimerer ^4.

RA er en liten lipofilt metabolitt av vitamin A som induserer differensiering neural ^{5, 6.} Høye konsentrasjoner av RA fremme nerve genekspresjon og undertrykker mesodermal genekspresjon i løpet av EB formasjon ^{7, 8.} RA er produsert av vitamin A-oksydasjon til retinaldehyde ved enten alkohol eller retinol-dehydrogenase, etterfulgt av retinaldehyde oksydasjon til det endelige produkt ved retinaldehyde dehydrogenase ^9. Neural differensiering krever transport av RA fra cytoplasma til kjernen ved cellulære RA-bindende protein 2 (CRABP2). I kjernen, RA bindes til sin tilhørende reseptor-komplekset som består av en RAR-RXR heterodimer ^10. Dette resulterer i rekruttering av transkripsjonelle ko-aktivatorer, og initiering av transkripsjon ^{9, 11.} Videre fremmer RA nedbrytningen av fosforylert (aktiv) Smad 1, således antagonisering BMP og SMAD signale ^12. I tillegg til disse aktiviteter øker RA Pax6 uttrykk, en transkripsjonsfaktor som støtter nevrale differensiering ^13. RA signale moduleres av Sirtuin-1 (SIRT1), en kjernefysisk nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD +) – avhengig enzym som deacetylates CRABP2, interferere med dens translokasjon til kjernen, og følgelig med RA-binding til RAR-RXR heterodimer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Vårt mål i utformingen av RA-behandlede EB protokollen som er beskrevet her er for å optimalisere neural differensiering for å lette in vitro-analyse av de signalveier som regulerer ESC differensiering til neuronale forløperceller. En av fordelene ved denne protokollen er tilrettelegging av analyse av cellefunksjon ved immunfluorescens. 3D EBS ikke er godt gjennomtrengt av antistoffer og er vanskelige å bilde. EB dissosiering i et 2D-monolaget på bestemte tidspunkter i løpet av neural differensiering letter immunmerking og avbildning av cellene ved hjelp av konfokal mikroskopi.

Protocol

1. Culture of Mouse embryonale fibroblaster (MEFs) Forbered MEF medium, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, høy glukose), supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS). Coat 100 mm cellekulturskåler med 0,5% gelatinoppløsning i 30 minutter ved romtemperatur (RT). Telle MEFs ved hjelp av en cytometer. Fjern gelatinoppløsningen og før den helles MEF medium forvarmet til 37 ° C. Hurtig tines hetteglass med mitomycin-C-behandlede MEFs i et 37 ° C vannbad i 2 minutter, deretter frø…

Representative Results

Oct4, Nanog, og SOX2 er kjernen transkripsjonsfaktorer som utviser ESC selvfornyelse og pluripotency. Vi anvendte den ovennevnte protokoll for å sammenligne det neurale differensiering av ESCs fra villtypen og fra en stamme av genetisk modifiserte mus hvor Syx, et gen som koder for den RhoA spesifikke utveksling faktor Syx, blir forstyrret. Vi hadde innblandet Syx i angiogenese 18. Vi la merke til forskjeller i atferd av EBS aggregeres fra Syx +…

Discussion

I denne protokollen presenterer vi en forholdsvis enkel og tilgjengelig metode for å studere nevrale differensiering av murine ESCs. I tidligere protokoller, ble RA tilsatt til mediet på dag 2 og dag 4 av den EB hengende dråpe ⁸ eller ved suspensjonskultur ^7, henholdsvis, eller umiddelbart etter EB hengende dråpe aggregering ^21. I protokollen vi utviklet, ble RA lagt tidligere. Til tross for den tidligere innføring av RA til EBS dannet av suspe…

Materials

Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging