2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center,Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology,Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center,Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University
Summary
我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。
Abstract
（典型的には、日E3.5で）胚盤胞の内部塊から単離されたマウス胚性幹細胞（ESC）は、初期胚発生を研究するためのin vitroモデル系として使用することができます。白血病抑制因子（LIF）の非存在下で、ESCの神経前駆細胞にデフォルトで分化します。彼らが原因初期段階の胚との類似性に球状凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれる3次元（3D）に集めことができます。 EBは、それらが2次元（2D）の拡張を成長させることによって展開ここで、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、またはそれらは球状体として成長し続けると、3つの胚葉に分化する3次元コラーゲンマトリックスに埋め込むことができる：内胚葉、中胚葉、および外胚葉。 3Dコラーゲン文化がより密接に、2DのEBより生体内環境を模倣します。 2D EB培養物は、分化を追跡するために、免疫蛍光法およびイムノブロッティングによる分析を容易にします。私たちは、二段階の神経differentiaを開発しましたションプロトコル。第1のステップでは、EBを、ハンギングドロップ法によって生成され、そして、同時に、レチノイン酸（RA）への曝露によって分化するように誘導されます。第二工程において、RAの非存在下での2Dまたは3D形式の神経分化が進行します。
Introduction
ESCは胚盤胞の内部細胞塊に由来します。彼らは起源の生物の任意の細胞型に分化する能力を持っている、すなわち、これらの細胞は、多能性があります。 ESC のin vitro分化は、発生経路とメカニズムを調べるための実験システムとして幅広い重要です。それは、細胞や組織の機能不全を補正するための新しい治療アプローチをテストするための強力かつ柔軟なモデルシステムを提供しています。 EBは、初期胚発生時の細胞分化の多くの側面を再現します。胚致死は難しい胚欠陥1,2の細胞の基礎を決定することができる場合、特に、EBを使用することができます。 EBを懸滴または液体懸濁液技術3のいずれかによって形成することができます。前者の利点は、このように、実験の再現性を容易に、一貫したサイズおよび密度のEBSを生成する能力です。
<p cLASS =「jove_contentは」>細胞外マトリックス（ECM）接着タンパク質との相互作用は、付着細胞の運動性および生存に影響を及ぼし得ます。 2D培養システムにおいて、フィブロネクチンは多くの場合、基板への細胞接着を高めるために適用されます。フィブロネクチンは、細胞表面インテグリンヘテロ4の10種類によって認識される基底膜成分です。RAは、神経分化5,6を誘導するビタミンAの小さな親油性代謝物です。 RAの高濃度は、神経遺伝子の発現を促進し、EB形成の7,8の間中胚葉遺伝子発現を抑制する。 RAは、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ9により最終製品にレチンアルデヒド酸化、続いてのいずれかでアルコールまたはレチノールデヒドロゲナーゼによってレチンアルデヒドへの酸化ビタミンAによって製造されます。神経分化は、細胞質からRAの輸送を必要としますセルラRA結合タンパク質2（CRABP2）によって核へ。核内で、RAは、RAR-RXRヘテロ二量体10からなるその同族受容体複合体に結合します。これは、転写コアクチベーターの動員、および転写9、11の開始をもたらします。さらに、RAは、このようにBMPとSMAD 12シグナル伝達拮抗、リン酸化（活性）SMAD1の分解を促進します。これらの活動に加えて、RAは、Pax6の発現、神経分化13を支持する転写因子を増加させます。 RAシグナリングはサーチュイン1（SIRT1）、核ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD +）により変調される- CRABP2を脱アセチル化依存性酵素、核へのトランスロケーションを妨害し、したがってRAは、RAR-RXRヘテロダイマー14,15に結合すると、 16。
e_contentは">ここで説明するRA処理したEBのプロトコルを設計する際の我々の目標は、神経前駆細胞へのESCの分化を調節するシグナル伝達経路のin vitroでの解析を容易にするために、神経分化を最適化することである。このプロトコルの利点の一つの促進であります免疫蛍光法による細胞機能の分析。3DのEBが十分な抗体が貫通し、画像に困難であるれていない。EB解離2D単層に特定の時点で神経分化中には、共焦点顕微鏡による細胞の免疫標識及びイメージングを容易にします。Protocol
マウス胚線維芽細胞の1文化（MEFの） MEF培地中、15％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）を、準備します。 室温（RT）で30分間0.5％ゼラチン溶液でコート100ミリメートル細胞培養皿を。 サイトメーターを使用したMEFを数えます。ゼラチン溶液を除去し、直ちに37℃に予め温めMEF培地を注ぎます。急速100mmのゼラチンコートデ?…
Representative Results
OCT4、Nanogの、およびSOX2は、ESCの自己再生および多能性を付与するコア転写因子です。我々は、野生型からとSYX、RhoAの特異交換因子SYXをコードする遺伝子は、破壊された遺伝子改変マウスの株からESCの神経分化を比較するために上記のプロトコルを適用しました。我々は、血管新生18でSYXを関与していました。 ESCは、および場合SYXの神?…
Discussion
このプロトコルでは、我々は、マウスESCの神経分化を研究するため、比較的簡単で、アクセス方法を提示します。以前のプロトコルでは、RA、または直ちにEBドロップ・アグリゲーション21を吊り下げた後に、それぞれ、2日目又はEBのハンギングドロップ8又は懸濁培養7によるの4日目に培地に添加しました。私たちが考案したプロトコルで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、AHにNIHの助成R01 HL119984によってサポートされていました
Materials
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).