Analyse af retinoidsyre-induceret Neural Differentiation af muse embryonale stamceller i to og tre-dimensionelle embryoide legemer
Summary
Vi beskriver en teknik til anvendelse af murine embryonale stamceller til generering af to- eller tredimensionale embryoide legemer. Vi derefter forklare, hvordan at inducere neural differentiering af embryoide kropsceller ved retinsyre, og hvordan man analyserer deres tilstand af differentiering ved progenitorcelle markør immunofluorescens og immunoblotting.
Abstract
Muse embryonale stamceller (ESC'er) isoleret fra den indre blastocyt (typisk ved dag E3.5), kan anvendes som in vitro modelsystem til undersøgelse tidlig fosterudvikling. I fravær af leukæmiinhiberende faktor (LIF), økonomiske og sociale råd differentiere som standard i neurale precursorceller. De kan samlet i en tredimensional (3D) sfæriske aggregat betegnes embryoid legeme (EB) på grund af dens lighed med den tidlige fase embryo. EB'er kan podes på fibronectinovertrukne dækglas, hvor de ekspanderer ved dyrkning todimensionale (2D) udvidelser, eller indført i 3D collagenmatricer hvor de fortsat vokser som sfæroider, og differentierer til de tre kimlag: endodermal, mesodermal og ectodermal. 3D kollagen kultur efterligner in vivo miljø tættere end 2D EB'er. 2D EB kultur letter analyse ved immunofluorescens og immunoblotting at spore differentiering. Vi har udviklet en to-trins neurale differentieringtion protokol. I det første trin, er EB'er genereres af hængende-dråbe-teknikken, og samtidig induceres til at differentiere ved udsættelse for retinsyre (RA). I det andet trin, neurale differentierings forløber i en 2D- eller 3D-format i fravær af RA.
Introduction
Økonomiske og sociale råd stammer fra blastocyst indre cellemasse. Disse celler er pluripotente, dvs. at de har kapacitet til at differentiere til en hvilken som helst celletype i organismen for oprindelse. ESC in vitro differentiering har bred interesse som et eksperimentelt system til at undersøge udviklingsmæssige veje og mekanismer. Det giver en potent og fleksibel modelsystem til afprøvning af nye terapeutiske metoder til korrektion af celler og væv dysfunktion. EB rekapitulere mange aspekter af celledifferentiering under tidlig embryogenese. Især kan EB'er anvendes, når embryoletalitet gør det vanskeligt at bestemme den cellulære grundlag af embryonale defekter 1, 2. EB'er kan dannes enten af hængende dråbe eller flydende suspensionsteknikker 3. Fordelen ved førstnævnte er evnen til at generere EB'er af ensartet størrelse og densitet, hvilket vil lette eksperimentelle reproducerbarhed.
<p class = "jove_content"> Interaktion med ekstracellulære matrix (ECM) adhæsionsproteiner kan påvirke motilitet og overlevelse af adhærente celler. I 2D-dyrkningssystem, der fibronectin ofte anvendes til at øge celle vedhæftning til underlaget. Fibronectin er et basalt lamina komponent anerkendt af 10 typer af celleoverflade-integrin heterodimerer 4.RA er en lille lipofil metabolit af vitamin A, som inducerer neural differentiering 5, 6. Høje koncentrationer af RA fremme neural genekspression og undertrykker mesodermal genekspression under EB formation 7, 8. RA fremstilles ved vitamin A oxidation til retinaldehyde ved enten alkohol eller retinol dehydrogenase, efterfulgt af retinaldehyde oxidation til slutproduktet ved retinaldehyde dehydrogenase 9. Neural differentiering kræver transport af RA fra cytoplasmaet til kernen ved cellulær RA-bindende protein 2 (CRABP2). I kernen, RA binder til dens beslægtede receptor kompleks bestående af en RAR-RXR heterodimer 10. Dette resulterer i rekruttering af transkriptionelle co-aktivatorer, og initiering af transkription 9, 11. Endvidere RA fremmer nedbrydningen af phosphoryleret (aktiv) SMAD1, således antagonisere BMP og SMAD signalering 12. Ud over disse aktiviteter, RA øger Pax6-ekspression, en transkriptionsfaktor, der understøtter neural differentiering 13. RA signalering moduleres ved sirtuin-1 (SIRT1), et nukleart nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) – afhængigt enzym, deacetylerer CRABP2, interferere med dets translokation til kernen, og dermed med RA binding til RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vores mål i udformningen af RA-behandlede EB protokol beskrevet her er at optimere neural differentiering for at lette in vitro analyse af signalveje, der regulerer ESC differentiering til neuronale precursorceller. En af fordelene ved denne protokol er lettelse af analysen af cellefunktion ved immunofluorescens. 3D EB'er ikke godt gennemtrænges af antistoffer og er vanskelige at billedet. EB dissociation i en 2D monolag på bestemte tidspunkter i løbet af neural differentiering letter immunmærkning og afbildning af cellerne ved konfokal mikroskopi.Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol præsenterer vi en relativt enkel og tilgængelig metode til at studere neural differentiering af murine ESC'er. I tidligere protokoller blev RA tilsat til mediet på dag 2 eller dag 4 af EB hængende-dråbe 8 eller ved suspensionskultur 7 henholdsvis eller umiddelbart efter EB hængende dråbe aggregering 21. I den protokol vi udtænkt, blev RA tilføjet tidligere. Trods den tidligere introduktion af RA til EB'er dannet ved…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud R01 HL119984 til AH
Materials
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
