Vi beskriver en teknik för användning av murina embryonala stamceller för generering av två eller tre dimensionella embryoidkroppar. Vi förklarar sedan hur man framkalla neural differentiering av embryoida kroppens celler av retinoinsyra och hur man analyserar deras tillstånd av differentiering av stamceller markör immunofluorescens och immunoblotting.
Mus embryonala stamceller (ESC) som isolerats från den inre massan av blastocysten (typiskt vid dag E3.5), kan användas som in vitro-modellsystem för att studera tidig embryonal utveckling. I frånvaro av leukemihämmande faktor (LIF), ESC differentierar som standard till neurala prekursorceller. De kan samlat till en tredimensionell (3D) sfäriska aggregat benämnda embryoid kropp (EB) på grund av dess likhet med det tidiga stadiet embryot. EBs kan ympas på fibronektinbelagda täckglas, där de expanderar genom att odla två dimensionella (2D) förlängningar, eller implanteras i 3D kollagenmatriser där de fortsätter att växa som sfäroider, och differentierar till de tre groddblad: endodermala, mesodermala och ektodermalt. 3D collagen kulturen härmar in vivo miljö närmare än 2D EBS. 2D EB kulturen underlättar analys genom immunofluorescens och immunoblotting att spåra differentiering. Vi har utvecklat en tvåstegs neural differentieringtion-protokollet. I det första steget, är EBs genereras av hängdropp- teknik, och, samtidigt, induceras att differentiera genom exponering för retinsyra (RA). I det andra steget, neurala differentieringsfortskrider i en 2D- eller 3D-format i frånvaro av RA.
ESCs härrör från blastocysten inre cellmassan. Dessa celler är pluripotenta, dvs de har förmågan att differentieras till alla celltyper hos organismen ursprungsland. ESC in vitro differentiering är av stort intresse som ett experimentellt system för att utreda utvecklingsvägar och mekanismer. Det erbjuder en potent och flexibel modell för att testa nya terapeutiska metoder för korrigering av cell- och vävnads dysfunktion. EB rekapitulera många aspekter av celldifferentiering under tidig embryogenes. I synnerhet, kan EBs användas när embryonal dödlighet gör det svårt att bestämma den cellulära basen av de embryonala defekter 1, 2. EBs kan bildas antingen av den hängande droppen eller vätskesuspensionstekniker 3. Fördelen av den förra är förmågan att generera EBs av konsekvent storlek och densitet, vilket underlättar experimentell reproducerbarhet.
<p class = "jove_content"> Interaktion med extracellulära matrix (ECM) adhesionsproteiner kan påverka motilitet och överlevnad av vidhäftande celler. I 2D-odlingssystemet, är fibronektin ofta tillämpas för att öka cellvidhäftning till substratet. Fibronektin är ett basal lamina komponent som känns igen av 10 typer av cellytan grin heterodimerer 4.RA är en liten lipofil metabolit av vitamin A som inducerar neural differentiering 5, 6. Höga koncentrationer av RA främja neural genexpression och undertrycker mesodermala genuttryck under EB formation 7, 8. RA är producerad av vitamin A oxidation till retinaldehyd genom antingen alkohol eller retinol dehydrogenas, följt av retinaldehyd oxidation till den slutliga produkten genom retinaldehyd dehydrogenas 9. Neural differentiering kräver transport av RA från cytoplasman till kärnan genom cellulär RA-bindande protein 2 (CRABP2). I kärnan, binder RA till dess besläktade receptor komplex bestående av en RAR-RXR heterodimer 10. Detta resulterar i rekrytering av transkriptionella co-aktivatorer, och initieringen av transkription 9, 11. Vidare RA befrämjar nedbrytningen av fosforylerade (aktiva) Smad1, således antagonisera BMP och SMAD signalering 12. Förutom dessa aktiviteter ökar RA Pax6 uttryck, en transkriptionsfaktor som stöder neural differentiering 13. RA-signalering moduleras av sirtuin-1 (SIRT1), en nukleär nikotinamidadenindinukleotid (NAD +) – beroende enzym som deacetylates CRABP2, interferera med dess translokation till kärnan, och således med RA bindning till RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vårt mål i utformningen av RA-behandlade EB protokoll som beskrivs här är att optimera neural differentiering för att underlätta in vitro-analys av de signalvägar som reglerar ESC differentiering till neuronala prekursorceller. En av fördelarna med detta protokoll är underlättande av analys av cellfunktionen genom immunofluorescens. 3D EBs är inte väl penetrerad av antikroppar och är svåra att bilden. EB dissociation till en 2D monoskikt vid specifika tidpunkter under neural differentiering underlättar immunomärkning och avbildning av cellerna genom konfokalmikroskopi.I detta protokoll presenterar vi ett relativt enkelt och tillgänglig metod för att studera neural differentiering av murina ESCs. I tidigare protokoll, till RA till mediet vid dag 2 eller dag 4 av EB hängdropp- 8 eller genom suspensionsodling 7, respektive, eller omedelbart efter EB hängande droppe aggregering 21. I protokollet vi fram var RA lagt tidigare. Trots den tidigare införandet av RA till EBS bildas av suspensionskultur, producerade de…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NIH bidrag R01 HL119984 till AH
Materials | |||
MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
Cell strainer | Corning | 352360 | |
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
PBS | Gibco | 10010049 | |
Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |