En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo
Summary
Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.
Abstract
La electroporación es un método que introduce genes de interés en organismos biológicamente relevantes como el embrión de pollo. Se ha establecido que el embrión de pollo es un modelo de investigación eficaz para estudiar las funciones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo. Más recientemente, el embrión de pollo se ha vuelto particularmente valioso en el estudio de la expresión génica, la regulación y la función asociada con la audición. En ovo la electroporación se puede utilizar para dirigir las regiones auditivas del tronco cerebral responsables de funciones auditivas altamente especializadas. Estas regiones incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM) y el núcleo laminaris (NL). NM y NL neuronas surgen de distintos precursores de rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmidos para estudiar las propiedades relacionadas con el gen en estas regiones. Se muestra un método para el control espacial y temporal de la expresión génica que promueven la ganancia o pérdida de funcional fenotipoEs Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con R5 / R6, se muestra la transfección de plásmidos en NM y NL. La regulación temporal de la expresión génica puede conseguirse adoptando un sistema vectorial tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox). La técnica de electroporación in ovo – junto con los ensayos funcionales bioquímicos, farmacológicos y / o in vivo – proporciona un enfoque innovador para estudiar el desarrollo de las neuronas auditivas y los fenómenos patofisiológicos asociados.
Introduction
La codificación neuronal rápida del sonido es esencial para las funciones auditivas normales. Estas incluyen las habilidades de localización de sonido 1 , el habla en la discriminación de ruido 2 , y la comprensión de otras señales de comunicación relevantes para el comportamiento 3 . Las neuronas análogas ubicadas en el tronco encefálico auditivo de aves y mamíferos son altamente especializados para la codificación neuronal rápida [ 4] . Estos incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM), el núcleo laminaris (NL) y sus análogos de mamíferos, el núcleo coclear anteroventral (AVCN) y el olivo medial superior (MSO), respectivamente 5 . Sin embargo, los mecanismos de desarrollo que regulan la codificación neural rápida son mal entendidos en el tronco encefálico auditivo. Por lo tanto, es ventajoso estudiar genes específicos que son responsables de la codificación neural rápida con el fin de comprender mejor su expresión, regulación y función en auDesarrollo territorial.
El embrión de pollo en desarrollo es una herramienta de investigación eficaz y bien establecida para estudiar las cuestiones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo 6 , 7 . Recientes avances moleculares han abordado estas cuestiones biológicas en el embrión de pollo en desarrollo mediante la expresión o derribar a los genes de interés con el fin de analizar la función de genes in vivo [ 8 , 9] . La investigación del papel regulador de genes específicos es un avance significativo en la comprensión de patologías asociadas con déficit auditivo. Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmido en el tronco encefálico auditivo de pollo donde la codificación neuronal rápida del sonido se produce 10 . Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con los rhombomeros 5 y 6 11 , 12 (R5 /R6), se muestra el control espacial de la transfección de plásmidos en NM y NL. Además, se muestra la regulación temporal de la expresión mediante la adopción de un sistema de vector tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox) [ 8] .
Protocol
Representative Results
Discussion
In ovo electroporación es un método de expresar o derribar los genes de interés con el fin de analizar in vivo la función génica [ 8 , 9] . En el embrión de pollo, es un método innovador para expresar genes codificados por plásmidos en diferentes regiones auditivas del tronco cerebral 8 . Para asegurar una expresión óptima, se requieren varios pasos críticos. En primer lugar, sólo inyectar embriones cuyos oto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los Dres. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andrés Barria y la señora Ximena Optiz-Araya para la asistencia inicial con la configuración del protocolo y para proporcionar plásmidos. Este trabajo fue apoyado por NIH / NIDCD subvención DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
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