I Ovo Electroporation i Chicken Auditory Brainstem
Summary
Auditoriska hjärnstammarneuroner av avians och däggdjur är specialiserade på snabb neural kodning, en grundläggande process för normala hörselfunktioner. Dessa neuroner härrör från tydliga prekursorer av embryonisk hindbrain. Vi presenterar tekniker som använder elektroporation för att uttrycka gener i bakbenet av kycklingembryon för att studera genfunktionen under hörselutveckling.
Abstract
Elektroporation är en metod som introducerar gener av intresse för biologiskt relevanta organismer som kycklingembryon. Det är länge etablerat att kycklingembryon är en effektiv forskningsmodell för att studera grundläggande biologiska funktioner för hörselsystemutveckling. På senare tid har kycklingembryot blivit särskilt värdefullt när man studerar genuttryck, reglering och funktion i samband med hörsel. I ovo kan elektroporation användas för att rikta sig till hörselhjärnstamregioner som är ansvariga för högspecialiserade hörselfunktioner. Dessa regioner innefattar kycklingkärnans magnocellularis (NM) och kärnan laminaris (NL). NM- och NL-neuroner uppstår från tydliga prekursorer av rhombomerer 5 och 6 (R5 / R6). Här presenterar vi i ovo elektroporation av plasmidkodade gener för att studera genrelaterade egenskaper i dessa regioner. Vi visar en metod för rumslig och tidsmässig kontroll av genuttryck som främjar antingen vinst eller förlust av funktionell fenotypes. Genom att rikta auditiva neurala progenitorregioner associerade med R5 / R6 visar vi plasmidtransfektion i NM och NL. Temporal reglering av genuttryck kan åstadkommas genom att anta ett tet-on-vektorsystem. Detta är ett läkemedelsinducerbart förfarande som uttrycker genen av intresse i närvaro av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporationstekniken – tillsammans med antingen biokemiska, farmakologiska och eller in vivo funktionella analyser – tillhandahålls ett innovativt tillvägagångssätt för att studera hörselnormutveckling och associerade patofysiologiska fenomen.
Introduction
Snabb neural kodning av ljud är avgörande för normala hörselfunktioner. Dessa inkluderar ljudlokaliseringsförmåga 1 , tal i brusdiskriminering 2 och förståelsen av andra beteenderelevanta kommunikationssignaler 3 . Analoga neuroner som finns i den auditiva hjärnstammen hos både avianer och däggdjur är högspecialiserade för snabb neural kodning 4 . Dessa inkluderar kycklingkärnans magnocellularis (NM), kärnlaminarisen (NL) och deras däggdjursanaloger, den anteroventrala cochleära kärnan (AVCN) och den mediala överlägsen olivan (MSO) respektive 5 . Utvecklingsmekanismer som reglerar snabb neuralkodning är emellertid dåligt förstådda i den auditiva hjärnstammen. Därför är det fördelaktigt att studera specifika gener som ansvarar för snabb neural kodning för att bättre förstå deras uttryck, reglering och funktion i auDiktutveckling.
Den utvecklande kycklingembryon är ett effektivt och väletablerat forskningsverktyg för att studera grundläggande biologiska frågor om hörsystemutveckling 6 , 7 . Nyliga molekylära framsteg har behandlat dessa biologiska frågor i det utvecklande kycklingembryon genom att uttrycka eller knacka ner gener av intresse för att analysera in vivo genfunktion 8 , 9 . Undersökning av specifika geners reglerande roll är en betydande framsteg när det gäller att förstå patologier som hör samman med hörselunderskott. Här presenterar vi i ovo elektroporation av plasmidkodade gener i den hönshörande hjärnstammen där snabb neural kodning av ljud inträffar 10 . Genom att rikta auditiva neurala progenitorregioner associerade med rombomerer 5 och 6 11 , 12 (R5 /R6) visar vi rumslig kontroll av plasmidtransfektion i NM och NL. Dessutom visar vi temporell reglering av uttryck genom att anta ett tet-on-vektorsystem. Detta är ett läkemedelsinducerbart förfarande som uttrycker genen av intresse i närvaro av doxycyklin (Dox) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
I ovo elektroporation är en metod att uttrycka eller knacka ner gener av intresse för att analysera in vivo genfunktion 8 , 9 . I kycklingembryon är det en innovativ metod för att uttrycka plasmidkodade gener i olika auditiva hjärnstamregioner 8 . För att säkerställa ett optimalt uttryck krävs flera viktiga steg. Först injicera endast embryon vars otocyter är tydligt synliga. Om otocyter inte är synliga är e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria och Mrs Ximena Optiz-Araya för första hjälpen med protokolluppsättningen och för att tillhandahålla plasmider. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCD-bidrag DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
