In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo
Summary
I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.
Abstract
L'elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l'embrione di pollo. È da tempo stabilito che l'embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l'embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell'espressione genica, della regolazione e della funzione associata all'udito. L' elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l'elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell'espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.
Introduction
La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora 1 , discorso in discriminazione di rumore 2 e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento 3 . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce 4 . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l'olio superiore mediale (MSO) rispettivamente 5 . Tuttavia, i meccanismi di sviluppo che regolano la codifica neuronale veloce sono poco compresi nel sistema cerebrale uditivo. Pertanto è vantaggioso studiare geni specifici responsabili della codifica veloce veloce al fine di comprendere meglio la loro espressione, regolazione e funzionalità in auLo sviluppo dei dati.
L'embrione di pollo in fase di sviluppo è uno strumento di ricerca efficace e consolidato per studiare le questioni biologiche fondamentali dello sviluppo del sistema uditivo 6 , 7 . Recenti progressi molecolari hanno affrontato queste questioni biologiche nell'embrione di pollo in fase di sviluppo esprimendo o abbattendo geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Indagare sul ruolo di regolamentazione di geni specifici è un progresso significativo nella comprensione delle patologie associate a deficit auditari. Qui presentiamo l'elettroporazione in ovo di geni codificati da plasmide nel tronco uditivo del pollo dove si verifica una veloce codifica neurale del suono 10 . Targetando regioni neuroni uditive uditive associate ai rombomeri 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostriamo il controllo spaziale della transfezione plasmida in NM e NL. Inoltre, mostriamo la regolazione temporale dell'espressione adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
L' elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Nell'embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo 8 . Per garantire un'espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i dottori. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e la signora Ximena Optiz-Araya per l'assistenza iniziale con il set-up del protocollo e per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NIH / NIDCD DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
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