هنا، يستخدم قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف مع ميزة تحليلية يقارن الصور التفصيلية المشرقة لثلاثة علامات للبلعمة الذاتية ويحدد مدى مشاركتها في التعريب، جنبا إلى جنب مع عد بقعة LC3، لقياس التلقيح الذاتي بطريقة موضوعية وكمية وإحصائية قوية.
أوتوفاجي هو مسار تقويضي في المكونات الطبيعية أو خلل التي تتراكم أثناء النمو والتمايز يتم تدهور عن طريق الليزوزوم وإعادة تدويرها. أثناء البلعمة الذاتية، يتم ترطيب البروتين السيتوپلازمي LC3 وتجنيده إلى الأغشية الذاتية. ثم يندمج الأوتوفاجوسوم مع الليزوسوم لتشكيل ال أوتوليسوسوم، حيث يحدث انهيار الحويصلة الذاتية و محتوياته. ويستخدم البروتين المرتبط ب أوبيكيتين p62، الذي يربط LC3، أيضا لمراقبة التدفق الذاتي. يجب أن الخلايا التي تمر البلعمة الذاتية تثبت التوطين المشترك لل p62، LC3، وعلامات الليزوزومية. وقد استخدم المجهر المناعي لتحديد بصريا LC3 بونكتا، p62، و / أو الليزوزومات على أساس كل خلية. ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على تقييم موضوعي ودقيق إحصائيا. للتغلب على هذه المشاكل، تم استخدام قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف جنبا إلى جنب مع ميزة تحليلية يقارن دي مشرق ديالذيل، من ثلاث علامات ذاتية (LC3، p62 و LAMP1 الليزوزومية) ويحدد توطين المشارك، جنبا إلى جنب مع العد بقعة LC3 لقياس البلعمة الذاتية بطريقة موضوعية وكمية، وإحصائيا قوية.
ماكرووتوفاجي، ويشار إليها فيما بعد باسم أوتوفاجي، هو مسار تقويضي حيث المكونات المتضررة أو مختلة، والبروتينات طويلة العمر، وعضيات يتم تدهور عن طريق الليزوزوم ويتم إعادة تدويرها 1 . أوتوفاجي هو عملية ديناميكية ومتعددة الخطوات التي تنطوي على تشكيل أوتوفاغوسوم. والانصهار من أوتوفاغوسوم مع ليسوسوم، وتشكيل أوتوليسوسوم. وتدهور محتويات أوتوليسوسوم 2 . علامة بيولوجية حاسمة تستخدم لتحديد التلقيح الذاتي في نظم الثدييات هو البروتين ذات الصلة انيبيب المرتبطة 1A / 1B- سلسلة الخفيفة 3 (LC3)، الذي يشكل غشاء ذاتي تلقائي. أثناء البلعمة الذاتية، مترافق LC3-1 عصاري خلوي إلى فوسفهاتيديليثانولامين لتشكيل LC3-إي. ثم يتم دمج LC3-إي في غشاء ذاتي تلقائي 3 . علامة أخرى تستخدم على نطاق واسع للتدفق الذاتي هو المستقبلة التلقائية سيكستوسوم 1 (SQSTM1، p62) الذي جسديا لينكس الشحنات التلقائية إلى غشاء ذاتي المنشأ 4 ، 5 .
الطرق التي استخدمت تقليديا لقياس البلعمة الذاتية هي البقع الغربية والمضان المجهري 7 . ومع ذلك، فإن أيا من هذه الأساليب تعتبر "المعيار الذهبي" ، 2 ، 6 كما أن هناك تحديات المرتبطة بكل من هذه التقنيات. لا تعطي البقع الغربية إلا متوسطا لأنها تستخدم عينة متجانسة، لذا لا يستطيع المراقبون رؤية ما يحدث في الخلايا الفردية. من ناحية أخرى، المجهر مضان يعطي معلومات مراقب على مستوى خلية واحدة، لكنه يفتقر إلى قدرات الإنتاجية، مما يجعل من الصعب الحصول على تقييمات موضوعية ودقيقة إحصائيا. في السنوات الأخيرة، وقياس LC3 و p62 بواسطة التصوير الخلوي المتعدد التدفق الخلوي (ميفك، انظر جدول المواد ) وقد اكتسب بوبووناريتي بسبب قدرتها الكمية، وقدرات الإنتاجية العالية، وإمكانية تعدد الإرسال، والقدرة على صورة كل خلية. واحدة من الطرق الأكثر استخداما لقياس التلقيح الذاتي باستخدام ميفك، جنبا إلى جنب مع برنامجها تحليل رفيق (انظر جدول المواد )، من خلال العد بقعة من العقدة LC3 أو أوتوفاغوسوميس 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . ومع ذلك، فإن زيادة في أوتوفاغوسوميس لا يعني بالضرورة أن هناك زيادة في البلعمة الذاتية، كما يمكن أن تمثل أيضا حصارا في هذه العملية 2 . LC3-إي دوران هو معلمة مفيدة لقياس التدفق الذاتي من خلال تحليل الخلايا في وجود وغياب مثبط تدهور الليزوزومية، مثل الكلوروكين. الكلوروكوين يمنع انصهار أوتوفاغوسوم إلى ليسوسوم، مما يسمح الكمي لتشكيل أوتوفاغوسوم كمقياس لدرجة البلعمة الذاتية عن طريق القبض على تدفق الذات الذاتي قبل أن يحدث تدهور الليزوزومية 18 . وبالإضافة إلى ذلك، يتم تدهور p62 في المقام الأول عن طريق البلعمة الذاتية، وإذا تم حظر تدهور الليزوزومية من أوتوفاغوسوم ومحتوياته، ومن المتوقع تراكم p62 17 ، 19 .
أوتوفاجي هو عملية متعددة المراحل، وقياس LC3 أو p62 وحدها لا توفر صورة كاملة لما يحدث في الخلايا. وقد أكدت المنشورات الحديثة على الحاجة إلى دراسة التشكيل المتزامن لل أوتيليسوسوم 2 ، 17 ، 20 ، 21 . ميفك هوقادرة بشكل فريد لقياس تشكيل جسيم حال ذاتي من تصوير المشارك توطين جسيم بلعمي ذاتي إلى يحلول 15-17، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا استكشاف التوطين المشترك ل p62 و LC3 باستخدام ميفك لقياس التدفق الذاتي الذاتي 5 . في برنامج التحليل المشار إليه، تسمى "الميزة" التي تقيس التعريب المشترك "تشابه التفاصيل المشرقة R3" (بدس) وتم تصميمها خصيصا لمقارنة تفاصيل الصورة الصغيرة والمشرقة لصورتين. بدس هو معامل ارتباط بيرسون الذي تم تحويله من السجل إلى النقاط المضيئة المترجمة مع نصف قطرها 3 بكسل أو أقل؛ وبعبارة أخرى، بدس بحساب درجة سفرلابينغ بكسل من اثنين من قنوات الفلورسنت مختلفة. أما النقاط المضيئة فهي إما مترابطة ( أي نفس المكان المكاني) أو غير مترابطة ( أي مواقع مكانية مختلفة). لذلك، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). معامل تحويل السجل لزيادة المدى إلى ما بين صفر و إنفينيتي 26 ، 27 . وقد لا تكون خدمات تنمية الأعمال التجارية وحدها كافية؛ راجان وآخرون. وجدت أن استخدام بدس فقط يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة 21 . يقيم بدس التوطين المشترك لعلامتين من البلعمة الذاتية ولكن لا يعتبر عدد الأوتوفاغوسومات. لحساب عدد الأوتوفاغوسومات، راجان وآخرون. وشملت فرز بقعة من L3 بونكتي 21 . راجان وآخرون. اقترح استخدام مؤامرة مبعثر ثنائي المتغير من عدد بقعة LC3 مقابل بدس. باستخدام هذه المؤامرة ثنائية المتغير، واثنين من السكان ورe التي تم تحديدها أولا: واحدة مع الخلايا التي لديها مستوى عال من البقع LC3 واحد مع الخلايا التي لديها مستوى منخفض من البقع LC3. تم تصنيف السكان البقعة العالية ل LC3 إلى مجموعتين: الخلايا ذات التوطين المشترك المنخفض ( أي تراكم الأوتوفاغوسومات) والخلايا ذات التوطين المشترك العالي ( أي تراكم الأوتوليسوسومات). هذه المؤامرة المتغيرين يسمح واحد للتمييز بين الخلايا مع عدد قليل جدا من أوتوفاغوسوميس والخلايا مع تراكم أوتوفاغوسوميس و / أو أوتوليسوسوميس 21 .
حتى الآن، لم يكن ممكنا التوطين المشترك في وقت واحد من LC3، p62، و LAMP1 (علامة الليزوزومية) باستخدام واحد "نوع الميزة" في برنامج تحليل رفيق ميفك (انظر جدول المواد ). ومع ذلك، فإن ميزة جديدة، أدخلت مؤخرا في الإصدار 6.1، ويسمى مشرق التفاصيل كولوكاليزاتيون 3 (BDC3). BDC3 يقارن الصور مشرق التفاصيل من كل من الصور الثلاث (في هذه الحالة، لك3، p62، و LAMP1) ويقيس التوطين المشترك من تحقيقات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). وتحسب ميزة BDC3 معامل ارتباط بيرسون المعدل ليشمل ثلاث صور. وبما أن النقاط المضيئة في الصور الثلاث إما مترابطة أو غير مترابطة، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). يتم تحويل معامل لتحويل السجل إلى زيادة النطاق الديناميكي بين 0 و اللانهاية. من خلال تحويل ميزة بدس مع ميزة BDC3، وطريقة التحليل التي قدمها راجان وآخرون. يمكن الآن دمج ثلاث علامات الأكثر استخداما لقياس البلعمة الذاتية في نظام واحد في نفس الوقت. القدرة على المشاركة في توطين هذه العلامات الثلاثة من البلعمة الذاتية في فحص واحد يمكن أن يؤدي إلى رؤى جديدة في تحريض وتنظيم البلعمة الذاتية. بروتوكول التالية الخطوط العريضة الخطوات للحث على البلعمة الذاتية في خلايا جوركات. تسمية الخلايا مع LC3، p62، و LAMP1 الأجسام المضادة. الحصول على البيانات على متعددةإترال التصوير تدفق مقياس الكريات. وتحليل البيانات لتقييم التدفق الذاتي.
عند تنفيذ هذا التحليل، هناك عدد قليل من الأشياء التي يجب مراعاتها. من المهم أن يكون لديك عينات التحكم المناسبة. لهذه التجربة، تم استخدام اثنين من الضوابط المختلفة: السيطرة والسيطرة + الكلوروكين. واستخدمت عينة التحكم لتحديد عتبة المناطق. وهو يمثل المستوى القاعدي من البلعمة الذاتية دون وقف تدهور الليزوزومية وهو السيطرة على عينة ستارفيد. ومع ذلك، فإن عينة التحكم ليست السيطرة المناسبة للمقارنة مع النتائج من ستارفيد + الكلوروكين عينة لأن الكلوروكين نفسه يؤثر على عينة السيطرة. لذلك، كان من الضروري أن يكون لديك عنصر تحكم + الكلوروكين.
قبل إجراء أي تحليل للبلعمة الذاتية، من المهم فقط تحليل / بوابة على الخلايا الفردية التي هي في التركيز ( أي رمز التدرج أكثر من 60)، حيث يمكن أن تتأثر النتائج إذا كان هناك أكثر من خلية واحدة أو الصور هي خارج تركيزي. ومن الأهمية بمكان أن الأوتوفاغوسومإس و ليسوسوميس في التركيز على عد السليم الصحيح وتحليل BDC3. يجب إزالة الخلايا الأبوطوزية قبل تحليل البلعمة الذاتية، لأنها قد تحرف النتائج ويجب عدم تضمينها. يجب أن يكون هناك تلطيخ المناسب لجميع علامات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). على سبيل المثال، جميع العلامات الثلاثة هي داخل الخلايا وينبغي أن يكون إشارة منقط. إذا كانت الإشارة لا منقط، أو إذا كان على سطح الخلية، فإن تلطيخ لا يكون مناسبا، وينبغي أن تجدد التجربة / تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، ل BDC3 لتكون دقيقة، فمن الضروري أن بوابة على الخلايا التي هي مشرقة لجميع علامات الفلورسنت الثلاثة من الفائدة. مطلوب الانطلاق على الأحداث الإيجابية لمنع قياس BDC3 على غير محددة ملزمة، والتحف التصوير، و / أو الضوضاء. هذا أمر بالغ الأهمية، كما يمكن BDC3 تضخيم التحف التي ليست إشارات حقيقية. منذ BDC3 لا يمكن أن يؤديها إلا على أحداث إيجابية مشرقة، قد لا يتم تضمين العديد من الخلايا في التحليل النهائي. هذا هو إسبكإيلي صحيح لخلايا السيطرة التي ليس لديها أي تراكم LC3، p62، و / أو LAMP1. وبالتالي، فإن الحد من هذا الفحص هو أن BDC3 يدرس فقط الخلايا التي هي إيجابية لجميع العلامات الثلاثة، والتي قد لا تكون مناسبة لجميع التجارب التلقائية.
مثل بدس، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا 15 ، 16 ، 17 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، BDC3 وحدها لا تأخذ في الاعتبار عدد عضيات البلعمة الذاتية التي تشارك في توطين، مما أدى إلى درجة كبيرة من التباين في عدد الأوتوفاغوسومات. ولذلك، فإن النهج ثنائي المتغيرات التي قدمها راجان وآخرون. كان موظف. وبالنظر إلى المؤامرات ثنائي المتغير، يمكن للمرء أن يسأل عما إذا كانيجب أن تكون الخلايا إيجابية ل LC3، p62، و LAMP1. لماذا هناك الكثير من الخلايا التي لديها 0 البقع؟ وذلك لأن إشارة LC3 قد تكون مشرقة بما فيه الكفاية للتوطين المشترك، ولكنها قد لا تفي بالعتبة المحددة بواسطة قناع الذروة (الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4)) اللازمة لكي تعتبر بقعة.
بروتوكول المقدمة هنا تستخدم ميفك لحساب LC3 بونكتا والمشاركة في توطين ثلاث علامات التلقيح الذاتي لقياس التدفق الذاتي. في ظل الظروف القاعدية (عينة التحكم)، كان عدد من أوتوفاغوسوميس منخفضة، وتم العثور على عدد قليل من الخلايا مع "البقع العالية". مع إضافة الكلوروكين، الذي يثبط الانصهار الذاتي / الانصهار ليسوسوم، كان هناك زيادة في عدد البقع LC3. منذ ليسوسوم غير قادر على كسر أوتوفاغوسوم و p62، الذي يقيم في أوتوفاغوسوم، وهذا يؤدي إلى زيادة في المشاركة في توطين ل LC3، p62، و LAMP1 تراكم أوتوليسوسوم. تم تضخيم هذا التأثير تحت ستارف المغذياتأيون، الذي يدفع إلى البلعمة الذاتية. ومع ذلك، من دون إضافة الكلوروكين، لم يكن هناك زيادة كبيرة في عدد من الأوتوفاغوسومات، على الأرجح بسبب زيادة في معدل دوران البلعمة الذاتية. عندما جوعت الخلايا في وجود الكلوروكين، كان هناك زيادة في التوطين المشترك وعدد من أوتوفاغوسوميس، وهو ما يدعم الاستنتاج بأن المجاعة تزيد من التدفق الذاتي. ومن المعروف إبس أن يكون محفز قوي من البلعمة الذاتية. ولذلك، من المتوقع أن تكون الزيادة كبيرة. إذا تم استخدام طريقة أخرى، مثل تحريض المخدرات، للحث على البلعمة الذاتية، قد يكون الفرق بين عنصر التحكم والعينات المعالجة أقل سطوعا.
وقد تم تصميم هذا البروتوكول خاصة لقياس البلعمة الذاتية في خطوط الخلايا البشرية، ولكن يمكن تكييف الفحص إلى الأنواع الأخرى عن طريق التحول إلى الأجسام المضادة لهذا النوع معين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام طريقة التحليل لأي تطبيق داخل الخلايا التي تتطلب المشاركة في التعريبمن ثلاثة تحقيقات / علامات.
The authors have nothing to disclose.
أود أن أشكر زملاء العمل في ميليبوريسيغما، فيليب J. موريسي و شيري L. صديق، على دعمهم وتوجيههم على مر السنين. وأود أيضا أن أشكر فيديا فينكاتاشلام وبريان R. دافيدسون لمساعدتهم مع ميزة BDC3 في برنامج إيدياس ، ريان P. جيسوب للمساعدة في تحرير هذه المخطوطة، ريموند كونغ للمساعدة في يوم اطلاق النار، وشكرا خاصا لك لفنان ماكياج سينثيا زامونتين.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |