Здесь для измерения аутофагии объективным, количественным и статистически устойчивым методом была использована мультиспектральная цитометрия проточного изображения с аналитическим признаком, который сравнивает яркие детализированные изображения 3 маркеров аутофагии и количественно их совместную локализацию, а также подсчет пятен LC3.
Автофагия – это катаболический путь, при котором нормальные или дисфункциональные клеточные компоненты, которые накапливаются во время роста и дифференцировки, деградируют через лизосому и рециркулируются. Во время аутофагии цитоплазматический LC3-белок липидируется и завербовывается в аутофагосомальные мембраны. Затем аутофагосома сливается с лизосомой, образуя автолизосому, где происходит распад авфагагосомного везикула и его содержимого. Связанный с ЫЦ3 белок ubiquitin p62, который связывается с LC3, также используется для контроля аутофагического потока. Клетки, подвергающиеся аутофагии, должны демонстрировать совместную локализацию p62, LC3 и лизосомных маркеров. Иммунофлуоресцентную микроскопию использовали для визуальной идентификации LC3 puncta, p62 и / или лизосом на основе каждой клетки. Тем не менее, объективная и статистически строгая оценка может быть трудно получить. Чтобы преодолеть эти проблемы, была использована мультиспектральная цитометрия протоков изображений, а также аналитическая характеристика, которая сравнивает яркую де-(LC3, p62 и lysosomal LAMP1) и количественно оценивает их совместную локализацию в сочетании с подсчетом пятна LC3 для измерения аутофагии объективным, количественным и статистически устойчивым образом.
Макроаутофагия, именуемая в дальнейшем аутофагия, представляет собой катаболический путь, в котором поврежденные или дисфункциональные компоненты, долгоживущие белки и органеллы деградируют через лизосому и рециркулируются 1 . Autophagy – это динамический, многоступенчатый процесс, который включает в себя формирование аутофагосомы; Слияние аутофагосомы с лизосомой, образующей автолизосому; И деградацию содержимого автолизосомы 2 . Важнейшим биологическим маркером, используемым для идентификации аутофагии в системах млекопитающих, является связанный с микротрубочками белок 1A / 1B-легкая цепь 3 (LC3), который составляет аутофагосомальную мембрану. Во время аутофагии цитозольный LC3-1 конъюгируют с фосфатидилэтаноламином с образованием LC3-II; Затем LC3-II включается в аутофагосомальную мембрану 3 . Другим широко используемым маркером для аутофагического потока является секвестроза 1 рецептора аутофагии (SQSTM1, p62), которая физически лиNks аутофагический груз на аутофагическую мембрану 4 , 5 .
Методы, которые традиционно используются для измерения аутофагию являются западные помарки и флуоресцентной микроскопии 7. Однако ни один из этих методов не считается «золотым стандартом», 2 , 6, поскольку существуют проблемы, связанные с обоими этими методами. Вестерн-блоты дают только среднее значение, потому что они используют образец гомогената, поэтому наблюдатели не могут видеть, что происходит в отдельных клетках. С другой стороны, флуоресцентная микроскопия дает информацию наблюдателя на уровне одной ячейки, но у нее нет пропускной способности, что затрудняет получение объективных и статистически строгих оценок. В последние годы измерение LC3 и p62 с помощью мультиспектральной цитометрии потока изображений (MIFC, см. Таблицу материалов ) набирает популярностьБлагодаря своей количественной мощности, высокой пропускной способности, потенциалу мультиплексирования и способности отображать каждую ячейку. Одним из наиболее широко используемых методов измерения аутофагии с использованием MIFC, а также сопутствующего анализа программного обеспечения (см. Таблицу материалов ) является точечный подсчет LC3 puncta или аутофагосом 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Однако увеличение аутофагосом не обязательно означает, что наблюдается увеличение аутофагии, так как это может также представлять собой блокаду в процессе 2 . Оборот LC3-II является полезным параметром для измерения аутофагического потока путем анализа клеток в присутствии иОтсутствие ингибитора лизосомной деградации, такого как хлорохин. Хлорохин ингибирует слияние аутофагосомы с лизосомой, тем самым позволяя количественно определять образование аутофагосомы как показатель степени аутофагии путем остановки аутофагического потока до того, как может произойти лизосомальная деградация 18 . Кроме того, P62 разлагаются в первую очередь аутофагией, и если деградация лизосомальная из аутофагоса и его содержимого блокируется, накопление p62 , как ожидаются , 17, 19.
Autophagy – это многоэтапный процесс, и измерение только LC3 или p62 не дает полной картины того, что происходит в клетках. Недавние публикации подчеркивали необходимость изучения одновременного формирования автолизосомы 2 , 17 , 20 , 21 . MIFCоднозначно способны измерять образование autolysosome путем визуализации совместной локализации с аутофагосом к лизосом 15 – 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Кроме того, была изучена совместная локализация p62 и LC3 с использованием MIFC для измерения аутофагического потока 5 . В упомянутом программном обеспечении анализа «функция», которая измеряет совместную локализацию, называется «Яркая детальность сходства R3» (BDS) и была специально разработана для сравнения небольших ярких деталей изображения двух изображений. BDS – логарифмированный коэффициент корреляции Пирсона локализованных ярких пятен с радиусом 3 пикселя или менее; Другими словами, BDS вычисляет степень oVerlapping пикселей из двух разных флуоресцентных каналов. Яркие пятна либо коррелированы ( т. Е. Одинаковое пространственное местоположение), либо некоррелированы ( т. Е. Разные пространственные местоположения). Следовательно, коэффициент корреляции изменяется от 0 (некоррелированный) и 1 (идеальная корреляция). Коэффициент log-преобразован для увеличения диапазона до нуля и бесконечности 26 , 27 . Только BDS может быть недостаточным; Rajan et al. Что использование только BDS может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам 21 . BDS оценивает совместную локализацию двух маркеров аутофагии, но не учитывает количество аутофагосом. Чтобы учесть количество аутофагосом, Rajan et al. Включал подсчет пятен LC3 puncta 21 . Rajan et al. Предложенный с использованием двумерного графика рассеяния для подсчета пятен LC3 по сравнению с BDS. Используя этот двумерный сюжет, две популяции werE сначала идентифицировали: один с клетками, которые имеют высокий уровень пятен LC3, и один с клетками, которые имеют низкий уровень пятен LC3. Точечная популяция с высоким LC3 была далее разделена на две популяции: клетки с низкой ко-локализацией ( т. Е. Накопление аутофагосом) и клетки с высокой ко-локализацией ( т. Е. Накопление аутолизосом). Этот двумерный график позволяет различать клетки с очень небольшим количеством аутофагосом и клеток с накоплением аутофагосом и / или аутолисосом 21 .
До сих пор одновременная совместная локализация LC3, p62 и LAMP1 (лизосомальный маркер) была невозможна с использованием единого «Тип функции» в программном обеспечении совместного анализа MIFC (см. Таблицу материалов ). Однако новая функция, недавно введенная в версии 6.1, называется Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 сравнивает яркие подробные изображения с каждого из трех изображений (в этом случае LC3, p62 и LAMP1) и количественно оценивает совместную локализацию трех зондов ( то есть LC3, p62 и LAMP1). Функция BDC3 вычисляет коэффициент корреляции Пирсона, модифицированный для расширения до трех изображений. Поскольку яркие пятна на трех изображениях коррелированы или некоррелированы, коэффициент корреляции колеблется между 0 (некоррелированный) и 1 (идеальная корреляция). Коэффициент log-преобразован для увеличения динамического диапазона между 0 и бесконечностью. Выключив функцию BDS с функцией BDC3, метод анализа, представленный Rajan et al. Теперь могут включать три наиболее используемых маркера для измерения аутофагии в одной системе одновременно. Способность локализовать эти три маркера аутофагии в одном анализе может привести к новым представлениям о индукции и регуляции аутофагии. В следующем протоколе излагаются шаги по индукции аутофагии в клетках Jurkat; Маркировать клетки антителами LC3, p62 и LAMP1; Получать данные поЭлектронный проточный цитометр; И проанализировать данные для оценки аутофагического потока.
При выполнении этого анализа необходимо рассмотреть несколько вещей. Важно иметь соответствующие контрольные образцы. Для этого эксперимента использовались два разных контроля: контроль и контроль + хлорохин. Образец контроля использовался для установки порога для регионов. Он представляет собой базальный уровень аутофагии, не останавливая лизосомальную деградацию, и является контрольным образцом для голодания. Однако контрольный образец не является подходящим контролем для сравнения с результатами образца Starved + Chloroquine, поскольку сам хлорохин влияет на контрольный образец. Поэтому необходимо было иметь контрольный образец + Хлорохин.
Прежде чем выполнять какой-либо анализ для аутофагии, важно только проанализировать / заблокировать отдельные ячейки, которые находятся в фокусе ( т. Е. Градиент RMS больше 60), поскольку результаты могут быть затронуты, если имеется более одной ячейки или изображения Вне фокуса. Крайне важно, чтобы аутофагосомEs и лизосомы находятся в центре внимания для правильного подсчета точек и анализа BDC3. Апоптотические клетки должны быть удалены до анализа аутофагии, поскольку они могут искажать результаты и не должны включаться. Должно быть соответствующее окрашивание для всех трех маркеров ( например , LC3, p62 и LAMP1). Например, все три маркера являются внутриклеточными и должны иметь точечный сигнал; Если сигнал не точечный или если он находится на поверхности клетки, окрашивание не будет подходящим, и эксперимент / окрашивание следует переделать. Кроме того, для того, чтобы BDC3 был точным, важно затворить ячейки, которые ярки для всех трех флуоресцентных маркеров, представляющих интерес. Для предотвращения измерения BDC3 на неспецифических связываниях, визуализационных артефактах и / или шуме необходимо провести стробирование на позитивных событиях. Это имеет решающее значение, поскольку BDC3 может потенциально усиливать артефакты, которые не являются истинными сигналами. Поскольку BDC3 может выполняться только на ярких позитивных событиях, многие клетки не могут быть включены в окончательный анализ; Это especЧто верно для контрольных клеток, которые не имеют накопления LC3, p62 и / или LAMP1. Таким образом, ограничение этого анализа состоит в том, что BDC3 рассматривает только клетки, которые являются положительными для всех трех маркеров, что может быть неприемлемым для всех экспериментов с аутофагами.
Подобно BDS, о котором ранее сообщалось 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , только BDC3 не учитывает количество органоидов аутофагии, которые локализуются, что в значительной степени Вариабельности числа аутофагосом. Поэтому двумерный подход, представленный Rajan et al. работал. Рассматривая двумерные сюжеты, можно спросить,Ячейки должны быть положительными для LC3, p62 и LAMP1; Почему так много клеток, у которых есть 0 пятен? Это связано с тем, что сигнал LC3 может быть достаточно ярким для совместной локализации, но он может не соответствовать порогу, установленному пиковой маской (пик (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)), необходимый для того, чтобы он считался место.
В представленном здесь протоколе используется MIFC для подсчета LC3 puncta и ко-локализация трех маркеров аутофагии для измерения аутофагического потока. В базовых условиях (контрольный образец) количество аутофагосом было низким, и было найдено несколько клеток с «высокими пятнами». С добавлением хлорохина, который ингибирует синтез аутофагосомы / лизосомы, наблюдалось увеличение количества пятен LC3. Так как лизосома неспособна разрушить аутофагосому и p62, которая находится в аутофагосоме, это приводит к увеличению колокализации скопления аутолизосом LC3, p62 и LAMP1. Этот эффект усиливали при питании starvatИон, который индуцирует аутофагию. Однако без добавления хлорохина не было значительного увеличения числа аутофагосом, что, скорее всего, связано с увеличением скорости аутофагиального оборота. Когда клетки подвергались голоданию в присутствии хлорохина, наблюдалось увеличение колокализации и количества аутофагосом, что подтверждает вывод о том, что голодание увеличивает аутофагический поток. Известно, что EBSS является мощным индуктором аутофагии. Поэтому ожидается, что увеличение будет большим. Если для индукции аутофагии используется другой метод, такой как индукция лекарственного средства, разница между контрольным и обработанным образцами может быть более тонкой.
Этот конкретный протокол был разработан для измерения аутофагии в клеточных линиях человека, но анализ можно было бы адаптировать к другим видам путем переключения на антитела для этих конкретных видов. Кроме того, метод анализа может быть использован для любого внутриклеточного применения, которое требует совместной локализацииИз трех зондов / маркеров.
The authors have nothing to disclose.
Я хотел бы поблагодарить своих коллег в MilliporeSigma, Philip J. Morrissey и Sherree L. Friend за их поддержку и руководство на протяжении многих лет. Я также хотел бы поблагодарить Видью Венкатачалама и Брайана Р. Дэвидсона за помощь в использовании функции BDC3 в программном обеспечении IDEAS , Ryan P. Jessup, для помощи в редактировании этой рукописи, Raymond Kong за помощь в день съемок, и особое спасибо Визажисту Синтии Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |