Her, multispectral bildebehandling flow cytometri med en analytisk funksjon som sammenligner lyse detaljbilder av 3 autophagy markører og kvantifiserer deres co-lokalisering, sammen med LC3 spot telling, ble brukt til å måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måte.
Autophagy er en katabolisk vei hvor normale eller dysfunksjonelle cellulære komponenter som akkumuleres under vekst og differensiering nedbrytes via lysosomet og resirkuleres. Under autofagi lipopseres cytoplasmatisk LC3-protein og rekrutteres til autofagosomale membraner. Autofagosomet smelter deretter sammen med lysosomet for å danne autolysosomet, hvor nedbrytningen av autofagosom vesikel og dens innhold forekommer. Det ubiquitin-assosierte proteinet p62, som binder til LC3, brukes også til å overvåke autofagisk flux. Celler som gjennomgår autofagi, skal demonstrere samlokalisering av p62, LC3 og lysosomale markører. Immunofluorescensmikroskopi har blitt brukt til å visuelt identifisere LC3 puncta, p62 og / eller lysosomer på en per-cell basis. Imidlertid kan en objektiv og statistisk streng vurdering være vanskelig å oppnå. For å overvinne disse problemene ble multispectral bildebehandlingsstrømcytometri brukt sammen med en analytisk funksjon som sammenligner den lyse deHale bilder fra tre autophagy markører (LC3, p62 og lysosomal LAMP1) og kvantifiserer deres co-lokalisering, i kombinasjon med LC3 spot telling for å måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måte.
Makroautofagi, heretter kalt autofagi, er en katabolisk vei hvor skadede eller dysfunksjonelle komponenter, langlivede proteiner og organeller nedbrytes via lysosomet og resirkuleres 1 . Autophagy er en dynamisk, multistep prosess som involverer dannelsen av et autophagosom; Fusjonen av autophagosomet med lysosomet, som danner autolysosomet; Og nedbrytning av innholdet i autolysosomet 2 . Den avgjørende biologiske markøren som brukes til å identifisere autofagi i pattedyrsystemer, er mikrotubulærassosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3), som utgjør autofagosomalmembranen. Under autophagy er cytosolisk LC3-1 konjugert til fosfatidyletanolamin for å danne LC3-II; LC3-II innlemmes deretter i autophagosomalmembranen 3 . En annen mye brukt markør for autophagic flux er autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) som fysisk liNks autophagic frakt til autophagic membranen 4 , 5 .
Metoder som tradisjonelt har blitt brukt til å måle autophagy er Western blots og fluorescensmikroskopi 7 . Imidlertid er ingen av disse metodene ansett for å være "gullstandarden" 2 , 6 da det er utfordringer knyttet til begge disse teknikkene. Western blots gir bare et gjennomsnitt fordi de bruker en homogenatprøve, slik at observatører ikke kan se hva som skjer i individuelle celler. På den annen side gir fluorescensmikroskopi observatørinformasjon på enkeltcellnivå, men det mangler gjennomstrømningsmuligheter, noe som gjør det vanskelig å oppnå objektive og statistisk strenge vurderinger. I de siste årene har måling av LC3 og p62 ved multispectral imaging flow cytometry (MIFC, se Table of Materials ) blitt å få popuÅpenhet på grunn av sin kvantitative kraft, høye gjennomstrømningsmuligheter, multiplekspotensial og evne til å bilde hver celle. En av de mest brukte metodene for å måle autophagy ved hjelp av MIFC, sammen med sin ledsageranalyseprogramvare (se Materialetabellen ), er gjennom punkttelling av LC3 puncta eller autophagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En økning i autofagosomer betyr imidlertid ikke nødvendigvis at det er en økning i autofagi, da det også kan representere en blokkad i prosessen 2 . LC3-II omsetning er en nyttig parameter for å måle autofagisk fluss ved å analysere celler i nærvær ogFravær av en lysosomal nedbrytningsinhibitor, slik som klorokin. Klokokin hemmer fusionen av autofagosomet til lysosomet, og derved tillater kvantifisering av autofagosomdannelsen som et mål for graden av autofagi ved å arrestere autofagisk fluss før lysosomal nedbrytning kan forekomme 18 . I tillegg nedbrytes p62 primært av autofagi, og hvis lysosomal nedbrytning av autofagosomet og dets innhold er blokkert, forventes en akkumulering av p62 17 , 19 .
Autophagy er en multistep-prosess, og måling av LC3 eller p62 alene gir ikke et komplett bilde av hva som skjer i cellene. Nylige publikasjoner har understreket behovet for å undersøke samtidig dannelse av autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC erunikt i stand til å måle dannelsen av autolysosome med CCD-ko-lokalisering av autophagosome til lysosomet 15 – 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. I tillegg har co-lokalisering av p62 og LC3 ved hjelp av MIFC blitt utforsket for å måle autofagisk flux 5 . I den refererte analysesoftware kalles "funksjonen" som måler co-lokalisering, "Bright Detail Similarity R3" (BDS) og ble spesifikt utformet for å sammenligne de små, lyse bildedetaljer av to bilder. BDS er den log-transformerte Pearsons korrelasjonskoeffisient for de lokaliserte lyse flekkene med en radius på 3 piksler eller mindre; Med andre ord, beregner BDS graden av oForlapping piksler fra to forskjellige fluorescerende kanaler. De lyse flekkene er enten korrelerte ( dvs. samme romlige plassering) eller ukorrelerte ( dvs. forskjellige romlige steder). Korrelasjonskoeffisienten varierer derfor mellom 0 (uncorrelated) og 1 (perfekt korrelasjon). Koeffisienten er loggetransformert for å øke området til mellom null og uendelig 26 , 27 . BDS alene kan ikke være tilstrekkelig; Rajan et al. Fant at bruk av bare BDS kan føre til falsk-positive eller falsk-negative resultater 21 . BDS evaluerer co-lokalisering av to markører av autofagi, men vurderer ikke antall autophagosomer. For å ta hensyn til antall autofagosomer, rajan et al. Inkludert spottelt av LC3 punkt 21 . Rajan et al. Foreslått å bruke en bivariate scatter plot av LC3 spot count versus BDS. Ved hjelp av denne bivariate plottet, to populasjoner werE først identifisert: en med celler som har et høyt nivå av LC3 flekker og en med celler som har lavt nivå av LC3 flekker. Høy-LC3-spotpopulasjonen ble videre klassifisert i to populasjoner: celler med lav co-lokalisering ( dvs. akkumulering av autofagosomer) og celler med høy co-lokalisering ( dvs. akkumulering av autolysosomer). Denne bivariate plottet tillater en å skille mellom celler med svært få autophagosomer og celler med akkumulering av autophagosomer og / eller autolysosomer 21 .
Inntil nå var det ikke mulig å bruke samtidige samlokalisering av LC3, p62 og LAMP1 (lysosomal markør) ved bruk av en enkelt "Feature Type" i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funksjon, nylig introdusert i versjon 6.1, kalles imidlertid Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 sammenligner de lyse detaljbildene fra hver av de tre bildene (i dette tilfellet LC3, p62 og LAMP1) og kvantifiserer samlokaliseringen av de tre probene ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). BDC3-funksjonen beregner Pearson korrelasjonskoeffisient modifisert for å strekke seg til tre bilder. Siden lyspunktene i de tre bildene er enten korrelerte eller ukorrelerte, varierer korrelasjonskoeffisienten mellom 0 (uncorrelated) og 1 (perfekt korrelasjon). Koeffisienten er loggetransformert for å øke det dynamiske området mellom 0 og uendelig. Ved å bytte ut BDS-funksjonen med BDC3-funksjonen, ble analysemetoden presentert av Rajan et al. Kan nå innlemme de tre mest brukte markørene for å måle autophagy i ett system samtidig. Evnen til å co-lokalisere disse tre markørene av autofagi i en enkelt analyse kan føre til ny innsikt i induksjon og regulering av autofagi. Følgende protokoll beskriver trinnene for å indusere autofagi i Jurkat-celler; Merk cellerne med LC3, p62 og LAMP1 antistoffer; Skaffe data på et multispillEktral imaging flow cytometer; Og analysere dataene for å vurdere autofagisk flux.
Når du utfører denne analysen, er det noen ting å vurdere. Det er viktig å ha passende kontrollprøver. For dette eksperimentet ble to forskjellige kontroller brukt: Kontroll og kontroll + klokokin. Kontrollprøven ble brukt til å angi terskelen for regionene. Det representerer det basale nivået av autofagi uten å stoppe lysosomal nedbrytning og er kontrollen for den sårede prøven. Kontrollprøven er imidlertid ikke en hensiktsmessig kontroll for å sammenligne med resultatene fra Starved + Chloroquine-prøven fordi klorokin selv påvirker kontrollprøven. Derfor var det nødvendig å ha en kontroll + klokokinprøve.
Før du utfører en analyse for autofagi, er det viktig å bare analysere / gate på enkelte celler som er i fokus ( dvs. gradient RMS større enn 60), da resultatene kan bli påvirket hvis det er mer enn en celle eller bildene er ute av fokus. Det er avgjørende at autophagosomEs og lysosomer er i fokus for riktig spot telling og BDC3 analyse. Apoptotiske celler må fjernes før autofaganalyse, da de kan skje resultater og bør ikke inkluderes. Det bør være passende farging for alle tre markørene ( dvs. LC3, P62 og LAMP1). For eksempel er alle tre markørene intracellulære og skal ha et punkteringssignal; Hvis signalet ikke punkterer, eller hvis det er på overflaten av cellen, vil fargingen ikke være hensiktsmessig, og forsøket / fargingen skal redoneres. I tillegg, for at BDC3 skal være nøyaktig, er det viktig å gate på celler som er lyse for alle tre fluorescerende markører av interesse. Gating på positive hendelser er nødvendig for å forhindre måling av BDC3 på ikke-spesifikk binding, bildefaktorer og / eller støy. Dette er avgjørende, da BDC3 potensielt kan forsterke artefakter som ikke er sanne signaler. Siden BDC3 kun kan utføres på lyse positive hendelser, kan mange celler ikke inkluderes i den endelige analysen; Dette er spesieltJeg er virkelig sant for kontrollceller som ikke har noen akkumulering av LC3, p62 og / eller LAMP1. En begrensning av denne analysen er således at BDC3 bare undersøker celler som er positive for alle tre markørene, noe som kanskje ikke passer for alle autofagiske eksperimenter.
Som BDS, som tidligere er rapportert 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , tar ikke BDC3 alene hensyn til antallet autofagorganeller som samlokaliserer, noe som resulterer i en stor grad Av variabilitet i antall autofagosomer. Derfor er den bivariate tilnærmingen presentert av Rajan et al. Ble ansatt. Ser man på de bivariate tomtene, kan man spørre omCellene må være positive for LC3, p62 og LAMP1; Hvorfor er det så mange celler som har 0 flekker? Dette skyldes at LC3-signalet kan være sterkt nok til samlokalisering, men det kan ikke oppfylle terskelen som er fastsatt av toppmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) som er nødvendig for at den skal betraktes som en få øye på.
Protokollen som presenteres her, brukte MIFC til å telle LC3 puncta og co-lokalisering av tre autophagy markører for å måle autophagic flux. Under basale forhold (kontrollprøve) var antallet autofagosomer lave, og få celler ble funnet med "High Spots." Med tillegg av klorokin, som hemmer autofagosom / lysosomfusjon, var det en økning i antall LC3 flekker. Siden lysosomet ikke klarer å bryte ned autofagosomet og p62, som ligger i autofagosomet, fører dette til en økning i co-lokalisering av LC3, p62 og LAMP1 autolysosom akkumulering. Denne effekten ble forsterket under næringsstjernenIon, som induserer autofagi. Imidlertid, uten tillegg av klorokin, var det ikke en signifikant økning i antall autofagosomer, trolig på grunn av økning i autofagisk omsetningsrate. Når celler ble sultet i nærvær av klorokin, var det en økning i co-lokalisering og antall autophagosomer, som støtter konklusjonen om at sulten øker autofagisk flux. EBSS er kjent for å være en kraftig inducer for autofagi. Det er derfor forventet at økningen vil være stor. Hvis en annen metode, så som medikamentinduksjon, brukes til å indusere autofagi, kan forskjellen mellom kontroll og behandlede prøver være subtilere.
Denne spesifikke protokollen ble utformet for å måle autophagy i humane cellelinjer, men analysen kunne tilpasses andre arter ved å bytte til antistoffer for den spesielle arten. I tillegg kan analysemetoden brukes til hvilken som helst intracellulær applikasjon som krever samlokaliseringAv tre prober / markører.
The authors have nothing to disclose.
Jeg vil gjerne takke mine kolleger på MilliporeSigma, Philip J. Morrissey og Sherree L. Friend, for deres støtte og veiledning gjennom årene. Jeg vil også gjerne takke Vidya Venkatachalam og Bryan R. Davidson for deres hjelp med BDC3 funksjon i IDEER programvare, Ryan P. Jessup for hjelp til å redigere dette manuskriptet, Raymond Kong for å få hjelp på dagen av skyting, og en spesiell takk Til makeup artist Cynthia Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |