Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Summary

Maus-neuronale Zellen, die auf Multi-Elektroden-Arrays kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach elektrischer Stimulation. Dieses Protokoll demonstriert, wie man Neuronen kultiviert, wie man Aktivität aufnimmt und wie man ein Protokoll aufbaut, um die Netze zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren.

Abstract

Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können verwendet werden, um die Toxizität von Medikamenten zu untersuchen, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation zu entwickeln und die Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen zu untersuchen. Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden wie Patch-Clamping, die nur die Aktivität von einer einzigen Zelle aufzeichnen können, können MEAs gleichzeitig von mehreren Standorten in einem Netzwerk aufzeichnen, ohne dass die schwierige Aufgabe besteht, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Darüber hinaus können zahlreiche Kontroll- und Stimulationskonfigurationen problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass ein breites Spektrum an Dynamik erforscht werden kann. Eine der Hauptdynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen angeben. Maus-neuronale Zellen, die auf MEAs kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach dem Training durch elektrische Stimulation induziert. Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert; Erfolgreich reSchnur von über 95% der plattierten Schüsseln; Ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren; Und sortieren, plotten und interpretieren die Ergebnisse aus solchen Experimenten. Die Verwendung eines proprietären Systems zur Stimulierung und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt. Softwarepakete werden auch verwendet, um neuronale Einheiten zu sortieren. Eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche wird verwendet, um Post-Stimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer zu visualisieren sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen. Schließlich werden repräsentative Ergebnisse und zukünftige Richtungen dieser Forschungsarbeit diskutiert.

Introduction

Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizität, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation und zur Untersuchung der Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen verwendet werden ¹ . Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden, wie z. B. Patch-Clamping, die nur die Aktivität aus einer einzigen Zelle oder Feldaufzeichnung mit einer Glaspipette aufzeichnen können, die extrazelluläre Reaktionen von den Neuronen aufnehmen kann, die die Elektrode an einer einzigen Stelle umgeben, können MEAs gleichzeitig gleichzeitig sein Aufzeichnung von mehreren Standorten in einer Zellkultur, ohne die schwierige Aufgabe, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Dies ermöglicht das Studium der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Zellengruppen, die ein Netzwerk innerhalb dieser Kultur bilden. Darüber hinaus sind die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die Netzwerkfeuerungsmuster ^{2 , 3 , 4 , 5} und die Netzwerksteuerung ^{6 <}/ Sup> in neuronalen Kulturen wurden gut dokumentiert, und zahlreiche Konfigurationen von elektrischer Stimulation und Kontrollen können problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass eine breite Palette von räumlich-zeitlichen Dynamiken erforscht werden kann.

Eine der wichtigsten Dynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen zeigen ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Das Peixoto-Labor untersuchte bisher die Effekte von hochfrequenten Trainingssignalen, wie in Ruaro et al. ¹⁴ , auf Netzwerken von Maus-Neuronen, die auf Mikroelektroden-Arrays plattiert sind. In diesen Experimenten zeigten die Netzwerke eine Zunahme der Antwort nachG Training durch elektrische Stimulation induziert. Die erhöhte Response wurde als eine Form des Lernens durch Stimuluserkennung betrachtet, wobei die Netzwerke in einer konsistenten Weise auf eine Veränderung des Reizes nach der Anwendung eines spezifischen Stimulations- ( dh Trainings-) Protokolls reagierten.

Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert, erfolgreich von über 95% der überzogenen Teller aufnehmen, ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren, einzelne Einheitsaktivitäten zu sortieren, Histogramme zu zeichnen und die Ergebnisse zu interpretieren Solche Experimente. Die Verwendung eines proprietären Systems (siehe Tabelle der Materialien ) für die Stimulation und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt, ebenso wie die Anwendung von Softwarepaketen (siehe Tabelle der Materialien ), um neuronale Einheiten zu sortieren . Eine kundenspezifische grafische Benutzeroberfläche (siehe Tabelle der Materialien ) dient zur Visualisierung von Post-sTimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen.

Protocol

Alle tierischen Verfahren folgen den NIH-Richtlinien und / oder der Public Health Services Policy über die Humane Care und Verwendung von Labortieren und sind unter einem institutionell genehmigten Tierpflege- und -verwendungsprotokoll (George Actions) an der George Mason University. 1. Materialvorbereitung Autoklavieren Sie folgende Materialien: 5,75 Zoll lange Glaspipetten, die vertikal in (2) 500 mL Becher, ca. 24 Stück Filterpapier (150 mm Durchmesser, jeweils in 8 Keile geschnitten, die Porengröße spielt keine Rolle), 1.000 μl gefilterte Pipette Spitzen, 200 μl gefilterte Pipettenspitzen, 10 μl gefilterte Pipettenspitzen und deionisiertes (DI) Wasser für die Waschungen (mindestens 200 mL). Bereiten Sie die Reagenzien und Medien vor. Bereiten Sie alle Reagenzien und Medien im Biohood mit aseptischen Techniken vor. Poly-D-lysin (PDL) gemäß Tabelle 1 vorbereiten. Mischen Sie die PDL mit sterilem DI-Wasser zu einem abschließenden cKonzentrierung von 50 μg / ml, wie folgt. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um 96 ml steriles DI-Wasser auf eine autoklavierte Glasreagenzflasche zu übertragen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um 4 ml steriles DI-Wasser zu der Hersteller-Durchstechflasche mit PDL zuzugeben. Lösen Sie die PDL durch Pipettieren. Verwenden Sie die gleiche Pipette, um die PDL-Lösung auf die Glasreagenzflasche zu übertragen, die das 96 ml sterile DI-Wasser enthält. Die Flasche fest verschließen, bevor man sie aus dem Biohood entfernt und die Lösung vorwirft. In der Biohood, teilen Sie die Lösung in 5-ml-Aliquots; Eingelassene Lösung bei -20 ° C einfrieren. Aufgetaute PDL kann einmal wieder eingefroren werden. Die aufgetaute Lösung verwerfen, wenn sie vorher wieder eingefroren wird. Lamininlösung gemäß Tabelle 2 vorbereiten. Mischen Sie das Laminin mit PBS auf eine Endkonzentration von 20 μg / ml, wie folgt. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um 49 ml PBS auf ein 50 mL Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Verwenden Sie eine sterile serologicaL Pipette, um 1 ml PBS dem Hersteller Fläschchen mit dem entsprechenden Gewicht des Laminins zuzusetzen. Das Laminin durch Pipettieren auflösen. Verwenden Sie die gleiche Pipette, um die Lamininlösung in das 50 ml-Zentrifugenröhrchen zu bringen, das die 49 ml PBS enthält. Das Röhrchen fest verschließen, bevor es aus dem Biohood entfernt und die Lösung verwirbelt wird. In der Biohood, teilen Sie die Lösung in 5 ml Aliquots; Eingelassene Lösung bei -20 ° C einfrieren. Aufgetautes Laminin kann nicht wieder eingefroren werden; Jede unbenutzte aufgetaute Lösung verwerfen. Vorbereiten des Speichermediums gemäß Tabelle 3 . HINWEIS: Speichermedium wird verwendet, um Gewebe bis zu einem Monat bei Umgebungs-CO 2 -Stufen zu speichern. Es kann gekauft werden (siehe Tabelle der Materialien), oder es kann mit dem allgemeinen Rezept von: ambient CO 2 -Zell Speichermedium + 2% serumfreie Ergänzung für neuronale Zellkultur + 0,5 mM Zellkulturmedium, das eine stabilisierte enthält, hergestellt werden Form von L-Glutamin (siehe Tabelle der Materialien). Um 10 ml Speichermedium zu bilden, transportieren Sie 10 ml Speichermedium für embryonales Gewebe ohne CaCl 2 in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Füge 210 μl serumfreies Supplement für die neuronale Zellkultur und 55 μl einer stabilisierten Form von L-Glutamin hinzu. Mischen Sie sanft durch Inversion. Da das Speichermedium lichtempfindlich ist, schützen Sie es, indem Sie die 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie abdecken. Aliquot 2 ml Speichermedium pro Röhrchen für insgesamt 5 Aliquots. In einem Kühlschrank für bis zu 2 Wochen oder bis zum Gebrauch aufbewahren, aber nicht einfrieren. Vorbereitung DMEM 5/5 Medium, wie in Tabelle 4 . Tau-Aliquote der serumfreien Ergänzung für neuronale Zellkultur, Pferdeserum (HS), fötales Rinderserum (FBS) und Ascorbinsäure. Tauen Sie ein Aliquot von Pen-Strep, wenn nötig, um die bakterielle Kontamination zu kontrollieren. Jede Zutat in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen pipettieren. Vergewissern Sie sich, dass die Pipettenspitzen keine Oberflächen oder Gegenstände berührenTs Im Inneren der Biohood, verbinden Sie den Filter mit dem Vakuumröhrchen mit dem Vakuum noch aus. Gießen Sie die Mischung in die Filteroberseite und schließen Sie sie. Schalten Sie das Vakuum im Biohood ein und lassen Sie das Medium auf den Boden des Behälters filtrieren. Ziehen Sie den Filter aus dem Vakuum, bevor Sie das Vakuum ausschalten. Ziehen Sie den Deckel auf dem sterilen Mediumbehälter fest, notieren Sie ihn und bewahren Sie das unbenutzte Medium bei 4 ° C für bis zu einem Monat auf. Öffnen Sie den Behälter im Biohood, um das Medium steril zu halten. Vorbereitung DMEM + Medium, wie in Tabelle 5 . Tau-Aliquoten der serumfreien Ergänzung für neuronale Zellkultur und Ascorbinsäure (und Pen-Strep, falls nötig). Jede Zutat in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen pipettieren. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5.2-1.2.5.3 für den verbleibenden Prozess. 2. Array / Dish Vorbereitung HINWEIS: Die in der Prozedur verwendeten MEAs sind 60-Kanal-Arrays oIn einem 8 x 8 Quadrat. Der Abstand der Zwischenelektrode beträgt 200 μm, und jede Elektrode hat einen Durchmesser von 10 μm. Das leitende Material für die Spuren ist Titan, und die Elektroden selbst sind aus TiN hergestellt. Der Glasring um die Elektroden ist 6 mm hoch, mit einem Außendurchmesser von 24 mm. Eine Kappe aus Polyoxymethylen (POM) wird verwendet, um die MEA zu bedecken, und ein gasdurchlässiger / flüssigkeitsundurchlässiger fluorierter Ethylenpropylen (FEP) -Film wird verwendet, um eine Kontamination während der Aufzeichnungs- und Stimulationssitzungen zu verhindern. Der Tag vor dem Überziehen. Machen Sie unbenutzte MEAs hydrophil, indem Sie sie Plasma aussetzen; Dies ist nach dem ersten Gebrauch meist nicht notwendig. Stellen Sie sicher, dass Glasdeckel, die für Kontrollkulturen verwendet werden, auch eine Plasmabehandlung erhalten. HINWEIS: Plastik-Petrischalen (35 mm) können auch als Kontrollschalen verwendet werden und benötigen keine Vorbehandlung. Verabreichen Sie die Plasmabehandlung mit einem Plasmaätzer für 40-60 s bei halber Leistung (50 W), wiTh der Kammerdruck auf 100-150 mT eingestellt. Füllen Sie sofort die MEAs mit DI Wasser. Tauchen Sie die Deckgläser in eine Petrischale, die mit DI-Wasser gefüllt ist. Lassen Sie das DI-Wasser ca. 15 min mit den behandelten Oberflächen in Kontakt. Im Inneren des Biohoods sauge das DI-Wasser ab. Füllen Sie die MEAs mit 70% Ethanol auf die Felge. Entfernen Sie das DI-Wasser aus der Petrischale mit den Deckgläsern und füllen Sie die Petrischale mit Ethanol, bis die Deckgläser vollständig untergetaucht sind. Lassen Sie diese für 10-15 min sitzen. Etikettieren Sie alle Petrischalen und kontrollieren Sie die Gerichte mit der MEA ID #, Datum der Chirurgie, Zelltyp und Initialen. Dann legen Sie jede MEA in ihre beschriftete Petrischale. Legen Sie die MEAs in einzelne Petrischalen und entfernen Sie das Ethanol mit Vakuumsaugung. Füllen Sie die MEAs mit sterilem DI-Wasser, um restliches Ethanol zu entfernen. Verwenden Sie Vakuumsaugung, um das DI-Wasser zu entfernen. Lass die MEAs im Biohood lufttrocknen. Füge 40-70 μl 50 μg / ml Poly-D-lysin hinzuE (PDL, hochmolekulares Gewicht, mindestens 50 kDa) zum Zentrum jeder MEA und 0,2 ml zu Kontrollen unter Verwendung von sterilen Pipettenspitzen. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie die Mitte der MEA nicht mit der Pipette berühren, da dies die Elektroden beschädigen kann. Die genaue Menge an PDL ist abhängig von der Hydrophilie der Oberfläche. Legen Sie ein kleines Stück Laborbedarf Papier in jede Schale und nass es mit sterilem Wasser zu vermeiden PDL Verdunstung über Nacht. Decken Sie alle Gerichte ab, bevor Sie sie aus dem Biohood entfernen. Legen Sie das Geschirr in einen Inkubator bei 37 ° C über Nacht. Überzugstag. Auf dem Plattierungstag tautet 1 Aliquot von Laminin (20 & mgr; g / ml); Jede MEA benötigt 40-50 & mgr; l Laminin, und jede Kontrollschale benötigt 0,2 ml Laminin. Berechnen Sie das Volumen des benötigten Laminins, basierend auf der Anzahl der zu verwendenden MEAs und Kontrollen. Übertragen Sie alle Gerichte vom Inkubator zum Biohood. Füllen Sie alle MEAs mit sterilenDI-Wasser mit einer sterilen serologischen Pipette und lassen sie für 10 – 15 min sitzen. Das DI-Wasser mit sterilen Pasteur-Pipetten ausspülen und den Vorgang zweimal wiederholen. Fügen Sie 40 – 50 μl des aufgetauten Laminins zur Mitte jeder MEA und 0,2 ml Laminin zu den Kontrollplatten mit sterilen Pipettenspitzen hinzu. Decken Sie alle MEAs und die Kontrollgerichte im Biohood ab und bringen Sie sie zu einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Laminin aus der Mitte der MEAs, indem Sie mit sterilen Pasteurpipetten saugt und die Oberfläche vor dem Plattieren lufttrocknen lassen. Lassen Sie das Geschirr im Biohood, oder legen Sie sie in einen Inkubator, bis sie bereit sind, die Zellen zu plattieren. HINWEIS: Die Gerichte können bis zum nächsten Tag im Inkubator bleiben. Wenn jedoch mehr Zeit benötigt wird, ist es ratsam, die Speisen zu reinigen und aus dem Poly-D-Lysin (PDL) Schritt zu beginnen (Schritt 2.1.6). 3. Embryo Entfernung und GehirnExtraktion Gießen Sie L-15 (Leibovitz) Medium in 4 der 100 mm Petrischalen. Decken Sie sie und legen Sie sie in ein -20 ° C Gefrierschrank, bis das Medium eine schlampige Konsistenz hat, aber nicht gefroren ist (~ 40-60 min). Führen Sie das ca. 40 min bis 1 h vor der Sektion. HINWEIS: Das wird die Embryonen und die Gehirne schnell abkühlen, so dass sie eine feste Konsistenz haben und bei der Extraktion nicht zerfallen. Bereiten Sie den Dissektionsbereich für Embryo-Entfernung vor. Legen Sie ein Tablett mit Eis in der Nähe eines Waschbeckens und legen Sie die chirurgischen Instrumente und Materialien für Embryo Entfernung. Dazu gehören 4 Petrischalen mit kaltem L-15 "Slush", Papiertücher, eine Sprühflasche mit 70% Ethanol, Blunt-Nase Daumenzange, feine Pinzette, kleine chirurgische Schere und große Schere ( Abbildung 1 ). Bereiten Sie den Dissektionsbereich für die Hirngewinnung vor. Legen Sie ein Glas Petrischale faCe in einem Tablett voller Eis. Legen Sie die chirurgischen Instrumente und Materialien für die Hirn-Extraktion, einschließlich Papiertücher, kleine chirurgische Schere, eine dünne doppelendige Spatel, eine Sprühflasche mit 70% Ethanol gefüllt, und eine Plastiktüte für die Entsorgung der Karkasse ( Abbildung 2 ). Setzen Sie auf einen Laborkittel, eine Gesichtsmaske und Handschuhe. Spray alle Arbeitsflächen, einschließlich der Handschuhe, mit 70% Ethanol. HINWEIS: Obwohl dies kein steriles Verfahren ist, ist es am besten, die Chancen der Kontamination so weit wie möglich zu reduzieren. Euthanisieren Sie eine E17-Timing-schwangere Maus nach den NIH-Richtlinien 16 und / oder Public Health Services Policy über die humane Pflege und Verwendung von Labortieren und unter einem institutionell anerkannten Tierpflege- und -verwendungsprotokoll (IACUC) für die CO 2 -Abyxiation. Achten Sie darauf, das CO 2 -Gas langsam in die Kammer über einen Zeitraum von 3 bis 5 Minuten zu entlassen, um keine Panik oder Disco zu vermeidenMfort in der maus Entkuppeln Sie die Maus und legen Sie sie auf ein Papiertuch, ventral nach oben. Sprühe den Unterbauch mit 70% Ethanol. Mit der kleinen chirurgischen Schere einen V-förmigen Schnitt durch die Haut und das subkutane Fett des Unterbauches machen, den Schnitt auf die distalen Enden der Thoraxhöhle ausdehnen und den Uterus aussetzen. Mit Pinzette, heben Sie den Uterus vorsichtig zwischen den Embryonen. Schneiden Sie das Bindegewebe mit Sektionsschere ab, bis der ganze Uterus frei ist. Spülen Sie den Uterus mit 70% Ethanol kurz, um Blut zu entfernen und legen Sie es in eine der 4 Petrischalen, die mit kaltem L-15 gefüllt sind. Lassen Sie jeden Embryo aus dem Uterus und dem inneren embryonalen Sack mit einem Paar feinpinsiger Pinzette. Sicherstellen, dass die Nabelschnur abgetrennt und der Plazenta-Sack entfernt wurde. Lege die befreiten Embryos in die zweite Schale voller Kälte L-15. Entgraten Sie die Embryos mit Pinzette und Schere. Mit Pinzetten, übertragen Sie die Köpfe auf eine dritte Petrischale und die KörperZu einem vierten, beide voller kalter L-15. 4. Frontal Cortex Entfernung In einem Biohood, legen Sie einen Keil von autoklavierten Filterpapier auf die gekühlte Glas Petrischale Bühne. Legen Sie einen einzelnen Embryokopf auf das Filterpapier. Griff den Schädel, indem du ein Paar Pinzetten durch die Okularhohlräume mit der nicht-dominanten Hand platzierst. Entfernen Sie die Haut und das darunter liegende Muskelgewebe mit einem Paar Irisschere. Legen Sie die Schneide der unteren Schere der Irisschere in die Basis des Schädels. Halten Sie die untere schiere gegen die innere Oberfläche des Schädels, weg vom Gehirn, schneiden Sie durch die Hinterhauptplatte und dann entlang der Mittellinie zwischen den Parietalplatten. Weiter schneiden rostral, zwischen den knorpeligen frontalen Schädelplatten. Beginnend in der Mitte der Hinterhauptplatte, einen senkrechten Schnitt nach links und rechts vom Mittelschnitt machen. Entfernen Sie das Gehirn, indem Sie sorgfältig einen kleinen Spatel zwischen der ventralen Oberfläche gleitenDes Gehirns und der unteren Schädelplatten, bis es vollständig unter dem Gehirn ist. Heben Sie den Spatel hoch; Das ganze hirn kommt intakt Lege ein paar Tropfen L-15-Medium auf das Filterpapier, damit das Gehirn nicht an dem Papier haftet und das Gehirn vorsichtig aus dem Spatel auf das Filterpapier schiebt. Die olfaktorische Glühbirne vorsichtig mit der Spitze des Spatels abschneiden. Mit einem sauberen Spatel, sehe den Stirnlappen in trapezförmigem Muster. Übertragen Sie das Gewebe auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das Speichermedium enthält. Wiederholen Sie die obigen mit den verbleibenden Embryonen. Achten Sie darauf, jedes Mal einen frischen Keil von Filterpapier zu verwenden ( dh ein Keil von Filterpapier pro Kopf). 5. Zelle Dissoziation Im Biohood die in Tabelle 6 aufgeführten Gegenstände zusammenstellen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um 5 ml DMEM + zu einer Ampulle von Papain zuzugeben. Erwärmte DMEM + kann verwendet werden, um den Papain besser aufzulösen. SanftPipette, um die lösung zu mischen. Verwenden Sie eine sterile Mikropipette, um 0,5 ml DMEM + zu einer Durchstechflasche mit DNase zuzugeben. Vermeiden Sie kraftvolles Pipettieren, während Sie die DNase-Lösung machen, denn DNase ist empfindlich gegen Scheren-Denaturierung. Übertragen Sie 2,5 ml Papain-Lösung in ein steriles Zentrifugenröhrchen und geben Sie 125 μl der DNase in die gleiche Röhre. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das verkappte Zentrifugenröhrchen etwa 8 mal sanft umkehren. Verwenden Sie eine sterile, breitlochige Pipette, entfernen Sie das Gewebe aus dem Röhrchen mit Speichermedium und legen Sie es in eine sterile, 35-mm-Petrischale. Sammeln Sie so wenig Medium wie möglich. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um so viel überschüssiges Speichermedium wie möglich zu entfernen, ohne das Gewebe zu entfernen. Das Gewebe sollte nicht in Medium schweben, aber es sollte feucht sein. Verwenden Sie zwei sterile Skalpellklingen, um das Gewebe zu zerkleinern. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um 2,5 ml der DNase / Papain-Mischung zu dem gehackten Gewebe in der Petrischale hinzuzufügen. Die Petrischale sanft strudeln, um sicherzustellen, dass tHut alles Gewebe ist frei in der Lösung und nicht an der Unterseite der Schale haften. Legen Sie die Schale in einen Inkubator 37 ° C für 15 min. Im Biohood verwenden Sie eine sterile, breitlochige Transferpipette, um alle Medien und Gewebe auf ein steriles, 5 mL Kryogenrohr zu übertragen. Legen Sie die Spitze der gleichen breiten Bohrung Transferpipette in der Nähe der Unterseite des Rohres. Vorsichtig durch langsames Pipettieren auf und ab 10-15 mal triturieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen während des Pipettierens. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer Small-Bore-Transferpipette, bis eine homogene Mischung erreicht ist. Wenn das Gewebe nicht dissoziiert wird, trituriert man mit einer 1000 μl Pipette. Füge 2 ml erwärmtes DMEM 5/5 zu der dissoziierten Zellmischung hinzu. Das Zentrifugenröhrchen schneiden, solange es noch im Biohood ist. Vorsicht mischen durch Inversion. Zentrifugieren bei etwa 573 xg für 5 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C). In der Biohood, verwenden Sie eine sterile serologische Pipette zu entfernen und verwerfen alle Überstand, ohne zu brechenPellet Verwenden Sie eine sterile Pipette, um 1 ml erwärmtes DMEM 5/5 dem Pellet in der Röhre zuzugeben, um die Zellen wieder zu suspendieren. Verwenden Sie eine sterile, klein gebohrte Transferpipette, um das Pellet durch sanftes Pipettieren auf- und abzubrechen, bis die Mischung homogen ist. HINWEIS: Vermeiden Sie es, beim Pipettieren Blasen zu bilden. Wenn sehr wenig Gewebe gesammelt wurde, fügen Sie nur 0,5 ml DMEM 5/5 hinzu. Innerhalb des Biohoods verwenden Sie eine sterile Pipette, um 10 μl der Zellsuspension auf ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Außerhalb des Biohoods werden 10 μl Trypanblau zu der 10 μl Zellsuspension im Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. HINWEIS: Dieser Schritt erfordert keine Sterilität. Legen Sie 10 μl der Trypan-blauen Zellsuspension in einen Einweg-Hämocytometer-Chip, um die Zellen zu zählen. 6. Beschichtungszellen In der Biohood, verwenden Sie eine sterile Mikropipette, um 50 μl Zellsuspension auf die Mitte jedes Arrays zu übertragen und jede Kontrolle Petrischale. Verwenden Sie eine PiPette tip pro teller Achten Sie darauf, die Zellen genau in die Mitte des Arrays zu stellen. Das Labor-Tissue-Papier, das in der Schale mit sterilem Wasser war, beneiden oder das neue Tissue-Papier in jede Schale geben. Decken das Geschirr ab. Legen Sie die bedeckten Petrischalen in einen Inkubator auf 37 ° C und 10% CO 2 für 3-4 h. In der Biohood, fügen Sie vorsichtig 1 ml erwärmtes DMEM 5/5 zu jeder MEA hinzu. HINWEIS: Vermeiden Sie das Waschen der Zellen aus dem mittleren Array beim Hinzufügen des Mediums (wichtig!). Sehr sorgfältig, verwenden Sie eine sterile Mikropipette, um einen Tropfen zu einer Zeit um die Innenkanten hinzuzufügen. Legen Sie eine Kappe mit einer gasdurchlässigen FEP-Membran auf jede MEA. Bringe sie zwei Tage in den Inkubator zurück. HINWEIS: Die Kappe verhindert Kontamination und Verdunstung. Folgen Sie der aseptischen Technik, trocknen Sie die Kappen im Biohood mit 100% Ethanol, bevor Sie sie auf die MEA stellen. Die Kulturen müssen innerhalb des Biohoods abgedeckt werden und müssen zu jeder Zeit verkappt bleiben. 7. HauptDie Kulturen Nach zwei Tagen einen kompletten Mediumersatz mit erwärmtem DMEM + durchführen. Übertragen Sie nur ein paar Gerichte vom Inkubator zum Biohood zu einer Zeit, um zu vermeiden, die Kulturen zu lange zu betonen. Verwenden Sie eine sterile 1-mL-Mikropipette, um das gesamte Medium aus der Schale herauszuziehen, indem Sie die Spitze der Pipette sorgfältig auf die Innenwand der Schale legen und dabei die Zellen in der Mitte vermeiden. Verwenden Sie nur eine Pipettenspitze pro Schale, um eine Verunreinigung zu vermeiden. Verwenden Sie eine sterile Mikropipette, um 1 ml warmes DMEM + abzugeben, wobei die Spitze der Pipette sorgfältig auf die Innenwand der Schale gelegt wird. Führen Sie 50% mittlere Änderungen mit erwärmtem DMEM +, wie oben beschrieben, 2-3 mal pro Woche und mit nicht mehr als 4 Tagen zwischen Fütterungen. Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Mikropipette, um 500 μl Medium aus der Schale herauszuziehen. Verwenden Sie eine sterile Mikropipette, um 500 μl warmes DMEM + abzugeben. </ Li> 8. Visuelle Inspektionen und Aufnahmen Überprüfen Sie die Tellerproben jeden zweiten Tag unter einem Mikroskop, um die Zellabdeckung über das Array zu suchen (mit 4X und 10facher Vergrößerung) und Kontamination (mit 20facher Vergrößerung), entweder Bakterien oder Pilz. HINWEIS: Abbildung 3a zeigt ein Beispiel für eine optimale Zellabdeckung, während Abbildung 3b eine Kultur mit schlechter Zelldichte zeigt. Zwei Wochen nach dem Plattieren, testen Sie eine Probe der MEA-Gerichte für spontane Aktivität. Aufzeichnung von MEAs, wie unten beschrieben, für 3-5 min. Spikes werden erkannt, wenn Aktivität vorhanden ist ( Abbildung 4 ). ANMERKUNG: Es ist Aufgabe des Experimentators, zu bestimmen, wann man mit dem Testen beginnen muss, basierend auf der Art des Experiments und der Hypothese, die untersucht wird. Um die Aktivität in einer MEA aufzuzeichnen, verwenden Sie folgende Geräte: Netzteil, Verstärker, Kopfstufe / Vorverstärker, Temperaturregler und Stimulationsgenerator (siehe Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 5 ). Bevor Sie die Kulturen aus dem Inkubator nehmen, stecken Sie den Temperaturregler ein und schalten Sie das System ein, indem Sie die Stromversorgung einschalten (gemäß den Anweisungen des Herstellers), so dass die beheizte Grundplatte des Vorverstärkers 35 ° C erreichen kann. Legen Sie die mit einer Kappe bedeckte Kultur in den Vorverstärker, so dass die schwarze Linie in der MEA gut mit der Referenzfläche übereinstimmt. Vergewissern Sie sich, dass die Vorverstärkerstifte aufgestellt sind, dass die Oberseite des Vorverstärkers gesichert ist und dass die Kulturkappe noch eingeschaltet ist. Sobald die Kultur in die Platte gelegt wird, deaktivieren Sie die Option "MEA ändern" auf der Datenerfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien für Softwarenamen und Benutzerhandbücher). Zusätzlich deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Blanking", bevor Sie irgendwelche Aufnahmen machen. Wähle "Download" in "MEA_Select" nach tEr Kultur wird in das System gestellt. Prüfen Sie, ob das Programm "Download OK" zeigt, bevor Sie fortfahren. Drücken Sie "Start" in der Softwareumgebung, um die Visualisierung der Signale zu starten. Im Hauptfenster wählen Sie: "Spikes" → "Erkennung" → "Automatik", ändern Sie den Wert "Std Dev" auf "5" und klicken Sie auf "Refresh", um den Schwellenwert zurückzusetzen. HINWEIS: Das "Spikes" -Fenster zeigt Spikes, die die Schwelle überschritten haben. Im Hauptfenster wählen Sie "Recorder" → "Recorder" → "Durchsuchen". Ändern Sie den Pfad und den Dateinamen, um Datum, Uhrzeit, Gericht und Experiment zu identifizieren. Stellen Sie die Zeitbegrenzung ( zB auf 5 min) ein. Klicken Sie auf "Stop", "Record" und "Play". Beachten Sie, dass die Aufnahme automatisch aufhört. Öffnen Sie die Stimulationssoftware. Wählen Sie "Recorder" → "Recorder" → "Durchsuchen", um eine Datei zu erstellen und das Tim einzustellenE begrenzen Klicken Sie auf "Stop", "Record" und "Play", um wieder aufzunehmen. Klicken Sie auf "Download and Start" (auf der Stimulationssoftware) für die Stimulation, die an die Schale geliefert werden soll. Wählen Sie in der Softwaresteuerung die Schaltfläche "MEA ändern", um das Geschirr zu wechseln. HINWEIS: Halten Sie die Kultur nicht länger als 30 min aus dem Inkubator, ohne ein System, um eine CO 2 -Atmosphäre rund um die Kultur zu erhalten. Wenn längere Aufnahmesitzungen erforderlich sind, verwenden Sie einen handelsüblichen Adapter, um CO 2 zu liefern. 9. Trainingsnetzwerke HINWEIS: Abbildung 6 zeigt eine Übersicht der nachfolgenden Schritte 9.1-9.3. Aufzeichnen einer 5-minütigen Grundlinie der spontanen Aktivität aus der Zellkultur (wie in Schritt 8 beschrieben). Sobald die Grundlinie etabliert ist, verabreichet eine 5-minütige Vor-Training-Sondierungsstimulation, bestehend aus einem 0,5 Hz biphasischenPuls mit einer Pulsdauer von 200 μs und einer Pulsamplitude von 900 mV (Abbildung 7a ) durch die ausgewählten Stimulationselektroden, wie in Abbildung 8 gezeigt (siehe Softwarehandbuch in der Tabelle der Materialien für Details zur Auswahl der Stimulationselektroden). Nach Beendigung der Vor-Training-Stimulation, verabreichen Sie ein "Training" -Protokoll zu den Netzwerken mit den gleichen Elektroden wie in der Sondierungsstimulation. Liefern Sie die Hochfrequenz-Züge einmal alle 2 s, wie in Hamilton et al. 15 ( Fig. 7b und Fig. 7c ). HINWEIS: Das Trainingssignal besteht aus 40 Pulszügen. Jeder Pulszug besteht aus 100 biphasischen Impulsen mit 4 ms zwischen Impulsen, einer Pulsdauer von 200 μs und einer Pulsamplitude von 900 mV. Nach Abschluss der Trainingszeit, verabreichen Sie eine 5-minütige Nach-Training Stimulation an die Zellen,Identisch mit der Vor-Training-Stimulation. Sobald die Post-Training-Stimulation endet, notieren Sie 5 min nach der Stimulation spontane Aktivität aus dem Netzwerk (wie in Schritt 8 beschrieben). Verwenden Sie eine separate Kontrollgruppe von MEAs, um mögliche Änderungen der Netzwerkreaktion aufgrund von natürlichen Schwankungen oder System-Nicht-Stationarität zu berücksichtigen. Verwalten Sie das gleiche experimentelle Protokoll, wie oben beschrieben, zu jenen Kontrollgruppen, mit der Ausnahme, dass die Kontrollgruppen eine Schein-Trainingsperiode erhalten, in der kein tatsächliches Trainingssignal verabreicht wird. 10. Datenanalyse Hinweis: Die Datendateien werden gespeichert und später in neuronale Einheiten mit einer proprietären Sortiersoftware sortiert (siehe Tabelle der Materialien). Eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche (GUI) wird verwendet, um die Einheiten zu laden und Bewegungsmuster in den Kulturen, Inter-Burst-Intervallen, Burst-Dauer und Post-Stimulus-Zeit-Histogramm (PSTH) zu analysieren (siehe Tabelle der Materialien). Das PSTH istDer wichtigste zu analysierende Graph, da er die Aktivität des Netzwerks in den Bin-Größen (der variablen Länge) anzeigt und so eine visuelle Darstellung der Antwort des Netzwerks auf die präsentierte Stimulation liefert. Konvertieren Sie die .mcd-Datendateien in das .plx-Format mit einer proprietären Sortiersoftware (siehe Tabelle der Materialien für Software-Namen und Benutzerhandbücher). Exportiere die .plx-Datei in eine neue .plx-Datei im selben Programm. Sortieren Sie die Kanäle in neuronale Einheiten ( Abbildung 9 ). Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten als .nex-Datei. Öffnen Sie die .nex-Datei in der entsprechenden Software (siehe Materialtabelle ) und speichern Sie sie als .mat-Datei, die mit der benutzerdefinierten GUI analysiert werden soll, die frei verfügbar ist (siehe Materialtabelle ). HINWEIS: Die grafische Benutzeroberfläche (siehe Tabelle der Materialien) zeichnet PSTHs entsprechend der Benutzereingabe ( dh PSTH , voreingestellter PSTH oder einzelner Kanal P ausSTH), was einen Überblick über das Stimulationsexperiment und einen sofortigen Vergleich zwischen den Post- und Pre-Stimulus-Dateien ermöglicht. Es zeigt auch die anfänglichen versus endgültigen PSTHs, die die Netzwerkantwort mit den ersten 6 und den letzten 6 Stimuli vergleicht. Die GUI führt mehrere andere Funktionen wie Spike-Rate, Inter-Spike-Intervall, Spikes pro Burst, Inter-Burst-Intervall und Burst-Dauer für beide Stimulationsdateien und Dateien mit spontaner Aktivität durch. Zuerst wählen Sie eine .mat-Datei mit Variablen, die Spike-Züge und eine Variable enthalten, die das Stimulations-Artefakt enthält; Das Skript analysiert die Daten, und die Haupt-GUI wird mit einem PSTH-Durchschnitt-Graphen auf der rechten Seite (Abbildung 10 ). Klicken Sie auf die aktiven Elektrodenknöpfe, um das einzelne PSTH (in blau) im Vergleich zum durchschnittlichen PSTH (in rot) zu sehen. HINWEIS: Die aktiven Elektroden werden gefärbt, um eine Wärmekarte zu zeigen, wo höhere Werte (mehr rot) größer sindPeak PSTH-Werte, was auf eine stärkere Reaktion auf Stimulation hindeutet. Wählen Sie eine Analyseoption mit dem Popup-Menü aus. Wählen Sie die Schaltfläche "Biased Average", um eine Teilmenge von Elektroden auszuwählen und den Durchschnitt dieser Teilmenge zu zeichnen. Dies ist nützlich für den Vergleich von Sub-Netzwerk-Verhalten innerhalb einer Kultur. HINWEIS: Es gibt mehrere verschiedene Analyseoptionen, die über das Popup-Menü ausgewählt wurden, und sie werden alle in der "Hilfe" -Taste in der Software erklärt. Wählen Sie die Schaltfläche "Grafik speichern", um den aktuell angezeigten Graphen als Jpeg-Datei mit hoher Auflösung zu speichern. Wählen Sie die Schaltfläche "Datentabelle", um die Daten in eine Tabellenkalkulation zu exportieren.

Representative Results

Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahrens ( Abbildung 11 ) wurden 60-Kanal-MEAs, die mit E17-Maus-Neuronalzellen plattiert wurden, inkubiert, bis die Kulturen die Arrays in einem gesunden Teppich von Zellen bedeckten (Abbildung 12 und Abbildung 3a ) . Nach 3 Wochen Inkubation bei 10% CO 2 und 37 ° C wurden die Kulturen auf spontane Aktivität unter Verwendung eines kommerziellen Aufzeichnungssystems (siehe Materialtabelle ) überprüft . Die Temperatur wurde bei 37 ° C während des Aufzeichnungsvorgangs unter Verwendung eines Temperaturreglers gehalten, da die Temperatur die neuronale Aktivität und die Brennrate beeinflusst. Prüfung auf Aktivität Spontan aktive Netzwerke weisen normalerweise unterschiedliche Signalmuster auf. Eine durchschnittliche aktive Kultur kann die Aktivität in einerCa. 40% der Elektroden. Von diesen aktiven Elektrodenstellen sind nahezu halbe Register-Spontansignale mit Brennraten von 5 – 10 Hz. Eine repräsentative Rasterkurve der spontanen Aktivität ist in Fig. 4a gezeigt . Die Häkchen markieren die Zeitstempel von Aktionspotentialen, die von 9 aktiven Elektroden während eines 20 s-Fensters mit einer Erfassungsrate von 25 kHz und einem Bandpassfilterbereich zwischen 300 Hz und 3 kHz aufgezeichnet wurden. Fig. 4b zeigt das Grundlinienrauschen und das gefilterte rohe extrazelluläre Signal während 8 Bursts von Aktivität vor dem Sortiervorgang. Um die Aktionspotentiale vom Rauschen zu trennen, werden die Schwellenwerte für jeden Kanal auf das 5-fache der Standardabweichung des Grundlinienrauschens eingestellt und über ein 500 ms-Fenster 15 berechnet. Vor der Analyse wurden die aufgezeichneten Spikes für jede Elektrode offline sortiert, um zwischen physio zu unterscheidenLogische Aktivität und Stimulation Artefakte mit einem K-Mittel-Algorithmus und Prinzip-Komponenten-Analyse. Signale, die als physiologische Reaktionen identifiziert wurden, wurden zusammengefasst, um eine Populationsreaktion an jeder Elektrode zu erzeugen (Abbildung 13 und Abbildung 9 ) . Ausbildung von neuronalen Netzen mit elektrischer Stimulation Netzwerke wurden unter Verwendung einer elektrischen Stimulation trainiert, die auf die Kultur direkt durch die MEA-Elektroden unter Verwendung eines Stimulusgenerators angewendet wurde (siehe Tabelle der Materialien). In diesem Satz repräsentativer Ergebnisse wurde eine "L" -förmige Konfiguration bestehend aus 13 Elektroden verwendet (Abbildung 8 ), obwohl viele andere Konfigurationen angewendet werden können. Die Sondierungs- und Trainingsstimulation basierte auf Parametern, die in Ruaro et al. </em> 14 Eine Grundlinie wurde zunächst durch Aufzeichnung von 5 min spontaner Aktivität vor der Stimulation eingestellt. Sobald die Grundlinie festgestellt wurde, wurde eine 5-minütige Vor-Trainings-Sondierungsstimulation, bestehend aus einem 0,5 Hz-Zweiphasen-Puls mit einer Pulsdauer von 200 μs und einer Pulsamplitude von 900 mV (Abbildung 7a ), über die ausgewählten Stimulationsstellen ( dh "L" -förmig). Ein Trainingsprotokoll wurde dann den Netzwerken alle 2 s unter Verwendung des gleichen Satzes von Elektroden verabreicht. Das Trainingssignal bestand aus 40 Pulszügen, die jeweils 100 biphasische Impulse mit einer 4-ms-Interpulsperiode, einer Pulsdauer von 200 μs und einer Pulsamplitude von 900 mV ( Fig. 7b und Fig. 7c ) enthielten. In dieser Trainingszeit folgte eine 5-minütige Nachschulphase, ähnlich der Vor-Training-Stimulation. Das Protokoll war dannMit einer 5-minütigen Aufnahme der post-stimulierenden spontanen Aktivität abgeschlossen. Das gleiche experimentelle Protokoll wurde auf eine Kontrollgruppe von Kulturen angewendet, um natürliche Schwankungen der Netzwerkreaktion zu berücksichtigen. Der einzige Unterschied im Kontrollprotokoll war jedoch die Anwendung einer Scheintrainingszeit, bei der kein aktuelles Trainingssignal verabreicht wurde. Statistische Analysen der Datensätze ( dh Training gegen Kontrolle) wurden mit einer einseitigen ANOVA durchgeführt, wobei die Variable "Training" als Zwischenfaktor war. Die Latenz wurde als In-Subjekt-Faktor verwendet. Wenn signifikante Interaktion gefunden wurde, wurde Tukey's Post-hoc-Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Vor-Trainings-Antwort innerhalb von 20 ms post-stimulus, obwohl der Bereich der Aktivität war inkonsistent nach der ersten Antwort. Allerdings zeigte die Post-Training-Aktivität nicht nur ar Esponse innerhalb der ersten 20 ms post-stimulus, wie es während des vortrainings gesehen wurde, aber es zeigte auch eine signifikante Aktivität von 30-50 ms post-stimulus (Abbildung 14 und Abbildung 15 ) 15 . Es gab auch eine statistisch signifikante Korrelation von "Spike-Frequenz" gegenüber "Zeit nach Stimulus" und "Spike-Zuverlässigkeit" gegenüber "Zeit nach Stimulus". "Spike-Zuverlässigkeit" kann definiert werden als die Wahrscheinlichkeit, eine Netzwerkantwort auf eine Stimulation zu sehen, wobei eine Antwort auf jeden Reiz einen Maximalwert von 1 zugewiesen wird. Abbildung 16 zeigt nahezu eine 50% ige Erhöhung der Spike-Frequenz sowie eine 30 -50% Erhöhung der Spike-Zuverlässigkeit für geschultes Netzwerk gegen die Kontrolle im Bereich von 20-50 ms nach-stimulus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ausbildung die Netzdynamik grundlegend verändert hat. 1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/> Abbildung 1 : Werkzeuge und Materialien, die für die Entfernung von Embryonen verwendet werden. ( A ) Eisgefülltes Tablett ( B ) Petrischalen gefüllt mit kaltem L-15 "Slush". ( C ) Papiertuch ( D ) Sprühflasche mit 70% Ethanol. ( E ) Feinzange (x2). ( F ) Kleine chirurgische Schere. ( G ) Blunt-Nase Daumenzange. ( H ) Große Schere. ( I ) Körpertasche Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2 : Werkzeuge und Materialien für die Hirnabsaugung. ( A </stronG>) Eisgefülltes Tablett ( B ) Petrischale mit Embryoköpfen. ( C ) Folienbeschichtetes Zentrifugenröhrchen mit Speichermedium. ( D ) Inverted Glas Petrischale. ( E ) Autoklaviertes Filterpapier ( F ) Becher mit 70% Ethanol. ( G ) Kunststoffpipette ( H ) Iris Schere. ( I ) Feine Pinzette. ( J ) Dünner doppelendiger Spatel. ( K ) Papiertuch Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3 : Optimale versus nicht-optimale Kulturen ( A ) zeigt einen gesunden Teppich von Zellen, die die Arrays abdecken, im Gegensatz zu ( B ),In denen es eine schlechte Zellproliferation gibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse der spontanen Aktivität. ( A ) Repräsentatives Rasterplot der spontanen Aktivität Die Tick-Markierungen zeigen Aktionspotentiale an, die von 9 aktiven Elektroden während eines 20-s-Fensters mit einer Erfassungsrate von 25 kHz und einem Bandpassfilterbereich zwischen 3 kHz und 300 Hz aufgezeichnet wurden. ( B ) Repräsentativ gefiltertes extrazelluläres Aktionspotential von einer aktiven Stelle. Abbildung geändert aus Referenz 15 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehenN dieser Figur. Abbildung 5 : Aufnahme Setup. ( A ) Stimulationsgenerator ( B ) Temperaturregler ( C ) Netzteil. ( D ) Verstärker. ( E ) Kopfstufe / Vorverstärker. ( F ) Capped MEA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6 : Schematische Darstellung des Ausbildungsprotokolls. Eine Anfangsbasislinie für 5 min und eine Sondenstimulation für 3 min aufzeichnen. Tetanische Stimulierung anwenden Für 90 s, die nicht aufgezeichnet ist. Auftragen und Aufzeichnen einer zweiten Sondenstimulation für 3 min und eine endgültige Grundlinie für 5 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 7 : Probing Stimulation und Training Signal Parameter. ( A ) Die Probing Stimulation besteht aus ± 900 mV bi-phasischen Impulsen, die mit einer Frequenz von 0,5 Hz verabreicht werden. ( B ) Pulszüge bestehen aus 100, ± 900 mV Bi-phasischen Impulsen bei einer Frequenz von 250 Hz. ( C ) Das Trainingssignal besteht aus 40 Pulszügen, die alle 2 s vergeben werden. Abbildung geändert aus Referenz 15 ."_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 8 : Darstellung der "L" -Form-Konfiguration. Quadrate repräsentieren einzelne Elektroden von einer MEA. Blaue Quadrate zeigen Elektroden an, die für die Stimulation verwendet werden, während alle anderen für die Aufzeichnung verwendet werden. Abbildung geändert aus Referenz 15 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 9 : Unterscheidungseinheiten von Geräuschen und Stimulationsartefakten. Die mehreren oberen Tafeln ( A – <stRong> C) in dieser Figur zeigen Beispiele von Lärm, um zu klären, was eine "Einheit" sein sollte. ( D ) Die gelbe Wellenform ist hier die einzige Einheit. ( E ) Die grüne Wellenform ist die einzige Einheit. ( F ) Beispiel eines Kanals, der von einer Elektrode aufgezeichnet wurde, die auch für die Stimulation verwendet wurde, wobei keine Einheiten aufgrund der Verstärkersättigung vernünftigerweise detektiert werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 10 : Post-Stimulus-Zeit-Histogramm (PSTH). Eine grafische Benutzeroberfläche (siehe Materialtabelle ) zeichnet die PSTHs entsprechend der Benutzereingabe auf ( dh PSTH , voreingestellter PSTH oder individuell)Kanal PSTH), was einen Überblick über das Stimulationsexperiment und einen sofortigen Vergleich zwischen den Post- und Pre-Stimulus-Dateien ermöglicht. Es zeigt auch die anfänglichen versus endgültigen PSTHs; Dies vergleicht die Netzwerkreaktion mit den ersten 6 und den letzten 6 Stimuli. Die GUI führt mehrere andere Funktionen wie Spike-Rate, Inter-Spike-Intervall, Spikes pro Burst, Inter-Burst-Intervall und Burst-Dauer für beide Stimulationsdateien und Dateien mit spontaner Aktivität durch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 11 : Überblick über die Zellpräparation und Beschichtung. ( A ) Eine E17-schwangere Maus wird mit CO 2 euthanasiert. ( B ) Die Maus ist decapitatEd und der Uterus wird entfernt. ( C ) Die Embryonen werden freigesetzt und enthauptet. ( D ) Das Gehirn wird aus jedem Embryo extrahiert und die frontalen Lappen werden entfernt. ( E ) Die Zellen werden dissoziiert. ( F ) Die dissoziierten Zellen werden in Medium suspendiert. ( G ) Die suspendierten Zellen werden auf 60-Kanal-Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 12 : Neuronale Kulturen auf Mikroelektroden-Arrays. Embryonale Mausneuronen werden auf 60-Kanal-MEAs plattiert, die die gleichzeitige Aufzeichnung der neuronalen Aktivität über das Netzwerk von jeder Elektrode ermöglichen. (Abbildung modifiziertAus Referenz 15 ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 13 : Sortierprogramm zum Sortieren der Wellenformen aus jedem Kanal. Das Sortierprogramm (siehe Materialtabelle ) lädt eine Datendatei und zeigt alle anfänglich für jeden Kanal erfassten Einheiten an. Eine von mehreren Methoden wird ausgewählt, um Signale bestimmten Einheiten zuzuordnen. In diesem Beispiel wurde der K-Mittel-Clustering-Algorithmus ausgewählt und die gelbe Einheit (mit der Bezeichnung "Einheit a" im unteren Fenster) identifiziert. Ein anderes Programm (siehe Materialtabelle ) wird dann verwendet, um die .nex-Datei in eine .mat-Datei zu exportieren, die die Eingabedatei für die benutzerdefinierte GUI ist (siehe <str Ong> Werkstofftabelle und Abbildung 10 ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 14 : Geänderte Netzwerkaktivität in Reaktion auf Stimulation nach einem Trainingszeitraum. Repräsentative Raster-Handlung von acht Elektroden. Die vertikale rote Linie gibt die Zeit des Stimulus an, und die schwarzen Markierungen markieren Aktionspotentiale. Im Vor-Training ( A ) gibt es eine sofortige Reaktion auf den Stimulus-Puls über Kanäle. Im Posttraining ( B ) zeigt das Netzwerk eine verlängerte Aktivitätsreaktion sowie die sofortige Reaktion auf die Stimulation 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 15 : Ausgebildete Netzwerke haben signifikant veränderte Spike-Frequenzen. Die Häufigkeit des Netzes, das für die Steuerungsnetze spritzt, wird berechnet, indem die Anzahl der Spikes über 50 ms unmittelbar nach jeder Stimulation und Division durch diesen Zeitraum integriert wird. Dargestellt ist der Durchschnitt von 12 trainierten und 10 Kontrollnetzwerken (die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an). Das Sternchen (*) gibt eine statistische Differenz ( p-Wert <0,05) zwischen den beiden Datensätzen an. Abbildung geändert aus Referenz 15 . Bitte klicken Sie hier um eine lar zu sehenVersion dieser Figur. Abbildung 16 : Synaptisch vermittelte Responses werden in trainierten Netzwerken signifikant modifiziert. ( A ) Die Spike-Zuverlässigkeit, gemessen in 10 ms-Bins und normalisiert auf die Steuerungsnetze, zeigt keine Änderung für die direkte Aktivierung von Neuronen in der Nähe von Elektroden (0-20 ms). Es gibt also keinen statistischen Unterschied zwischen Kontrollen und ausgebildeten Netzwerken für diese Bins. Auf der anderen Seite werden die länger-Latenz-Reaktionen (30-50 ms) synaptisch vermittelt, was anzeigt, dass diese Methode eine detailliertere Untersuchung der Zuverlässigkeit als in Abbildung 15 vorsieht. ( B ) Die Populationsspike-Frequenz wiederholt das Verhalten der Zuverlässigkeit und zeigt keine Modifikation für die direkte Aktivierung (0-20 ms), während ein statFür die längerfristigen Reaktionen (30-50 ms) wird ein signifikanter Unterschied festgestellt. Dieses Verhalten steht im Einklang mit den gemittelten Ergebnissen in der vorherigen Abbildung 15 . Die Fehlerbalken sind der Standardfehler des Mittelwerts, berechnet für 10 Steuerungsnetzwerke und 12 geschulte Netzwerke. (*) P-Wert <0,05; (**) p-Wert <0,001. Abbildung geändert aus Referenz 15 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Menge Artikel 1 Autoklavierte Glasreagenzflasche (mindestens 100 mL) 20 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen 1 10 ml sterile serologische Pipette 4 25 ml sterilE serologische pipette 2 50 ml sterile serologische Pipette 1 Zentrifugenröhrchen 150 mL Steriles DI-Wasser 5 mg Poly-D-lysin-Durchstechflasche Tabelle 1: PDL-Vorbereitung – Liste der Materialien und Reagenzien. Menge Artikel 1 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen 10 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen 2 1 ml sterile serologische Pipette 2 50 ml sterile serologische Pipette 1 Zentrifugenröhrchen 1 mL PhosphatPuffersalzlösung (PBS) 1 mg Laminin Tabelle 2: Lamininpräparation – Liste der Materialien und Reagenzien. Menge Artikel 1 Autoklavierte Glasreagenzflasche (mindestens 100 mL) 20 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen 1 10 ml sterile serologische Pipette 4 25 ml sterile serologische Pipette 2 50 ml sterile serologische Pipette 1 Zentrifugenröhrchen 150 mL Steriles DI-Wasser 5 mg Poly-D-lysin-Durchstechflasche <p clAss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Tabelle 3: Speichermedium Vorbereitung – Liste der Materialien und Reagenzien. Menge Artikel 44 ml DMEM mit einer stabilen Form von L-Glutamin (siehe Tabelle der Materialien) 1 mL Serumfreie Ergänzung für neuronale Zellkultur (siehe Tabelle der Materialien) 2,5 ml Pferdeserum 100 & mgr; l Ascorbinsäure [4 mg / ml] 2,5 ml Fetales Rinderserum (FBS) 0,5 ml Pen Strep (optional) 1 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen 2 25 ml sterile serologische Pipette 2 10 ml sterile serologische Pipette </ Td> 2 1 ml sterile serologische Pipette 1 250 mL Filter Tabelle 4: DMEM 5/5 Medium Vorbereitung – Liste der Materialien und Reagenzien. Menge Artikel 49 mL DMEM mit einer stabilen Form von L-Glutamin (siehe Tabelle der Materialien) 1 mL Serumfreie Ergänzung für neuronale Zellkultur (siehe Tabelle der Materialien) 100 & mgr; l Ascorbinsäure [4 mg / ml] 0,5 ml Pen Strep (optional) 1 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen 2 25 ml sterile serologische Pipette 2 1 ml sterile serologische Pipette 1 250 mL Filter Tabelle 5: DMEM + Medium Vorbereitung – Liste der Materialien und Reagenzien. Menge Artikel 1 Papain 140 U / Durchstechflasche 1 Dnase 1.260 U / Durchstechflasche 7 mL DMEM + (gekühlt) 5 ml DMEM 5/5 (erwärmt) 10 & mgr; l Trypanblau 2 Skalpellklingen 1 35 mm sterile Petrischale 4 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen 2 5 ml sterile Kryo-Rohre 2 2 ml sterile Kryo-Röhrchen 1 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen 1 Mikrozentrifugenröhrchen 2 Große Bohrung Transferpipette 3 Kleine Bohrung Transferpipette 5 2 ml sterile serologische Pipette 5 1 ml sterile serologische Pipette 2 10 μl sterile Mikropipettenspitzen 1 1000 μl sterile Mikropipettenspitzen 1 Hemocytometer-Chip Tabelle 6: Zelldissoziation – Liste der Materialien und Reagenzien

Discussion

Die Schritte, die in diesem Protokoll skizziert werden, liefern genügend Details für den Anfänger, um seine eigenen neuronalen Kulturen auf MEAs zu tafeln und Netzwerkaktivitäten aufzuzeichnen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass die Kulturen richtig haften, eine Teppichschicht von Zellen über den Elektrodenarrays bilden und seit Monaten gesund und kontaminationsfrei bleiben.

Obwohl es am besten ist, sich an alle Teile des Protokolls zu halten, gibt es während des gesamten Prozesses Schritte, die für das erfolgreiche Ergebnis entscheidend sind. Die Verwendung von aseptischen Technik während des gesamten Prozesses ist zwingend erforderlich, um zu verhindern, dass die Kulturen kontaminiert werden. Neue MEAs müssen hydrophil gemacht werden, wie im Protokoll beschrieben, oder es kommt zu einer schlechten Zelladhäsion. Durch die Vermeidung von harten Pipettieren und die Bildung von Luftblasen während der Dissoziation wird die Anzahl der beschädigten Zellen reduziert und führt zu einer höheren und gesünderen Ausbeute. Umschalten von DMEM 5/5 auf DMEM + nach dem erstenFütterung ist auch wichtig. DMEM 5/5 enthält Pferdeserum, das Gliazellen dazu veranlasst, die Kultur zu dominieren, wenn sie kontinuierlich verwendet wird und zu einer schlechten neuronalen Aktivität führen wird, obwohl die Kulturen gesund erscheinen werden ¹⁷ . Die Fütterung der Kulturen wie geplant und halten sie in ordnungsgemäße Inkubationsbedingungen ist auch entscheidend.

Plating Zellkulturen auf MEAs beinhaltet viele Variablen, die zu weniger als optimalen Ergebnissen führen können. Obwohl das Ziel ein perfekter "Teppich" von Zellen ist, führt das Versagen, die oben erwähnten kritischen Schritte zu lösen, zu einer schlechten Zellreifung oder einer Kontamination. Eine schlechte Zelladhäsion, die sich von der schlechten Zellreifung unterscheidet, ist ebenfalls ein Anliegen. Dies kann durch mehrere Faktoren verursacht werden, einschließlich der schlechten MEA-Vorbereitung vor dem Plattieren oder der Verwendung von altem Medium. Wenn altes Medium eine stabilisierte Form von L-Glutamin und serumfreie Ergänzung für die neuronale Zellkultur enthält (siehe Materialtabelle) Verwendet wird, die Zellen anfangs haften, aber dann schweben nach etwa zwei Wochen. Wenn bakterielle Kontamination ein anhaltendes Problem ist, kann dem Medium ein Antibiotikum, wie Ampicillin oder Pen-Strep, zugesetzt werden. Es gibt auch Fungizide zur Behandlung von Pilzkontaminationen. Dies sind einige der häufigsten Variablen, die das Ergebnis der Kulturen beeinflussen können. Es gibt viele andere, die nur nach Zeit und Erfahrung begegnet werden.

Im Vergleich zur Verwendung von Glasmikroelektroden eignet sich diese Technik hervorragend für das Studium der Netzdynamik und der pharmakologischen Reaktionen. Es ermöglicht die Verwendung von vielen verschiedenen räumlich-zeitlichen Stimulationsmuster und ermöglicht die Aufzeichnung von neuronalen Reaktionen aus mehreren Bereichen auf einmal. Vorherige Gruppen haben interessante Ergebnisse unter Verwendung von Protokollen gezeigt, die den hier beschriebenen ähnlich sind. Da die Kulturen für Wochen oder Monate dauern und die gleichen Kulturen wiederverwendet werden können, ist diese Technik auch einLlows für mehrere Experimente im Laufe der Zeit auf dem gleichen Netzwerk.

Allerdings gibt es Einschränkungen für diese Technik. MEAs sind nicht invasiv. Daher können sie nur extrazelluläre Aktivität aufnehmen, im Gegensatz zu Patch-Clamping oder intrazelluläre Aufzeichnung mit Pipetten. Da außerdem jede Elektrode in einem Array von mehreren Zellen bedeckt ist, ist es nicht möglich, die Aktivität eines einzelnen Neurons zu lösen. Umgekehrt, weil diese in vitro Kulturen sind, können sie nicht vollständig reproduzieren die strukturellen Eigenschaften von Netzwerken im Gehirn. Auch kann die Aktivität nur für weniger als 30 min zu einem Zeitpunkt aufgezeichnet werden, ohne dass ein Mechanismus eine CO & sub2 _; -Atmosphäre für die Zellen zur Aufrechterhaltung ihres pH-Gleichgewichts bereitstellt.

Sobald diese Technik beherrscht wird, können pharmakologische Manipulationen mit oder ohne elektrische Stimulation erforscht werden. Neue Protokolle zum Lernen und Gedächtnisbildung in neuronalen Netzwerken können auch entworfen und getestet werden, zusammen mit pRotationen für Hippocampus- oder Rückenmarksnetze. Protokolle für die Stimulierung und Schulung von Netzwerken wurden zuvor veröffentlicht, und einige von diesen wurden zu in vivo- Protokollen weiterentwickelt, wie die von Eytan et al. Vorgeschlagene "selektive Anpassung" ¹⁹ Mehrere Protokolle wurden getestet. Doch nur Ergebnisse aus einer von Ruaro im Jahr 2005 vorgeschlagenen Änderung des Tetanus-Verfahrens sind hier ^{14 , 20} dargestellt.

Materials

Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403	Make 4mg/mL aliquots
B-27	Invitrogen	17504-044	Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze
Beakers – glass – 100 mL	VWR	13912-160
Beakers – glass – 500 mL	VWR	10754-956
Blunt-tipped thumb forceps	World Precision Instruments	500365-G
Cryogenic vial – sterile, 2 mL	Fisher Scientific	10-500-26
Cryogenic vial – sterile, 5 mL	Fisher Scientific	10-500-27
DMEM with Glutamax	Gibco Life Technology	10569-010	Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine
DNase	Worthington Biochemical	LK003172
Ethanol	Fisher Scientific	04-355-451
Fetal bovine serum (FBS)	ATCC	30-2030
Fine-tipped thumb forceps	World Precision Instruments	501324-G
Glass Pipets	VWR	14673-010
GlutaMAX — I (100X)	Gibco Life Technology	35050-061	A stabilized form of L-glutamine used as a suplement
Hemocytometer chip	Fisher Scientific	22-600-101
Hibernate EB complete	BrainBits	D00118	Ambient CO2 cell storage media
Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12195H
Laminin	Sigma Aldrich	L2020-1MG
MCS filter amplifier	MultiChannel System	FA60SBC
MCS headstage/pre-amplifier	MultiChannel System	MEA1060-INV
MCS microelectrode array	MultiChannel System	60MEA200/10iR-ITO
MCS power supply	MultiChannel System	PS20W
MCS signal divider	MultiChannel System	SDMEA
MCS stimulus generator	MultiChannel System	STG4002
MCS temperature controller	MultiChannel System	TC02
Media storage bottle – glass 500 mL	VWR	10754-818	Autoclave
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL	Thermo Fisher	3485	Autoclave
Microcentrifuge tubes – 2 mL	Thermo Fisher	3434ECONO	Autoclave
Micropipette tips – 10 uL	VWR	37001-166	Autoclave
Micropipette tips – 1000 uL	VWR	13503-464	Autoclave
Micropipette tips – 200 uL	VWR	37001-596	Autoclave
Micropipetter – 10 uL	Thermo Fisher	4641170N
Micropipetter – 1000 uL	Thermo Fisher	4641210N
Micropipetter – 200 uL	Thermo Fisher	4641230N
Papain – 0.22 Filtered	Worthington Biochemical	LK003178
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)	Thermo Fisher	15070063
Petri dishes -100mm disposable	Fisher Scientific	08-757-100D
Petri dishes -100mm glass	VWR	10754-788
Petri dishes -35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A
Phosphate buffer saline (PBS) (1X)	Corning	21-040-CV
Plasma Cleaning System	Plasma Etch, Inc.	PE-50
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma Aldrich	P6407-5MG
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL	Fisher Scientific	05-527-90
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL	Falcon	352070
Procedure masks	Imco	1530-imc
Pyruvate	Sigma Aldrich	P4562-5G
Scalpel blades	World Precision Instruments	500237-G
Scissors – iris	World Precision Instruments	14111-G
Scissors – large	World Precision Instruments	14214
Scissors – small surgical	World Precision Instruments	501733-G
Serological pipette – sterile, 1 mL	VWR	89130-892
Serological pipette – sterile, 2 mL	VWR	89130-894
Serological pipette – sterile, 25 mL	VWR	89130-900
Serological pipette – sterile, 50 mL	VWR	89130-902
Software: Matlab GUI	Peixoto Lab	npeixoto@gmu.edu	Used to analyze .mat files.  Available for free upon request.  Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy.
Software: MCS MC_Rack	MultiChannel System	N/A	Used for data acquisition
Software: NeuroExplorer	Plexon	http://www.plexon.com/products/neuroexplorer	Used to convert .nex files to .mat
Software: Offline Sorter	Plexon	http://www.plexon.com/products/offline-sorter	Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex
Software Manual: MCS MC_Rack	MultiChannel System		https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf
Software Manual: NeuroExplorer	Plexon		https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf
Software Manual: Offline Sorter	Plexon		www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf
Spatula – small double-ended	World Precision Instruments	503440
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL	Millipore	SCGVU02RE
Transfer pipette – large bore	Thermo Fisher	335-1S
Transfer pipette – small bore	Thermo Fisher	242-1S
Trypan blue	Sigma Aldrich	T8154-20ML
Whatman filter paper	Whatman	1442 150	Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish