Las células neuronales de ratón cultivadas en matrices de múltiples electrodos muestran un aumento de la respuesta después de la estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar las neuronas, cómo registrar la actividad, y cómo establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a los patrones de estimulación.
Micro-electrodo arrays (MEAs) se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos, los paradigmas de diseño para la próxima generación de medicina personalizada, y estudiar la dinámica de la red en culturas neuronales. A diferencia de los métodos más tradicionales, como el patch-clamping, que sólo puede registrar la actividad de una sola célula, los MEA pueden grabar simultáneamente desde múltiples sitios en una red, sin requerir la ardua tarea de colocar cada electrodo individualmente. Además, numerosas configuraciones de control y estimulación pueden aplicarse fácilmente dentro de la misma configuración experimental, permitiendo explorar una amplia gama de dinámicas. Una de las dinámicas clave de interés en estos estudios in vitro ha sido la medida en que las redes cultivadas muestran propiedades indicativas de aprendizaje. Las células neuronales de ratón cultivadas en MEAs muestran un aumento en la respuesta después del entrenamiento inducido por estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar células neuronales en los AMUMA; Con éxitoCordón de más del 95% de los platos chapados; Establecer un protocolo para capacitar a las redes para responder a patrones de estimulación; Y clasificar, trazar e interpretar los resultados de tales experimentos. Se demuestra el uso de un sistema patentado para estimular y registrar cultivos neuronales. Los paquetes de software también se utilizan para clasificar las unidades neuronales. Se utiliza una interfaz gráfica de usuario personalizada para visualizar histogramas de tiempo post-estímulo, intervalos entre ráfagas y duración de ráfaga, así como para comparar la respuesta celular con la estimulación antes y después de un protocolo de entrenamiento. Finalmente, se discuten los resultados representativos y las direcciones futuras de este esfuerzo de investigación.
Micro-electrodo arrays (MEAs) se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos, los paradigmas de diseño para la próxima generación de medicina personalizada, y estudiar la dinámica de la red en culturas neuronales [ 1] . En contraste con métodos más tradicionales -como el patch-clamping, que sólo puede registrar la actividad de una sola célula, o grabación de campo con una pipeta de vidrio, que puede registrar las respuestas extracelulares de las neuronas que rodean el electrodo en un solo sitio-MEAs puede simultáneamente Registro de múltiples sitios en un cultivo celular sin requerir la ardua tarea de colocar cada electrodo individualmente. Esto permite el estudio de las interacciones dinámicas entre grupos de células que forman una red dentro de esa cultura. Además, los efectos de la estimulación eléctrica sobre los patrones de disparo de red 2 , 3 , 4 , 5 y el control de red 6 </ Sup> en cultivos neuronales han sido bien documentados, y numerosas configuraciones de estimulación eléctrica y controles pueden aplicarse fácilmente dentro de la misma configuración experimental, permitiendo explorar una amplia gama de dinámicas espacio-temporales.
Una de las dinámicas clave de interés en estos estudios in vitro ha sido la medida en que las redes cultivadas muestran propiedades indicativas de aprendizaje 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . El Laboratorio Peixoto examinó previamente los efectos de señales de entrenamiento de alta frecuencia, como se describe en Ruaro et al. 14 , en las redes de ratón neuronas plateado en microelectrode arrays [ 15] . En estos experimentos, las redes mostraron un aumento en la respuesta followinG de entrenamiento inducido por la estimulación eléctrica. El aumento de la respuesta se consideró una forma de aprendizaje a través del reconocimiento de estímulo, por lo que las redes respondieron de manera coherente a un cambio en el estímulo después de la aplicación de una estimulación específica ( es decir, el entrenamiento) del protocolo.
Este protocolo demuestra cómo cultivar células neuronales en MEAs, registrar exitosamente de más del 95% de los platos chapados, establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a patrones de estimulación, clasificar una sola unidad de actividad, trazar histogramas e interpretar los resultados de Experimentos. Se demuestra el uso de un sistema patentado (véase la Tabla de Materiales ) para la estimulación y registro de cultivos neuronales, así como la aplicación de paquetes de software (ver Tabla de Materiales ) para ordenar unidades neuronales . Una interfaz de usuario gráfica diseñada a medida (consulte la Tabla de materiales ) se utiliza para visualizar los post-sTimulus, intervalos entre ráfagas y duración de ráfaga, así como para comparar la respuesta celular con la estimulación antes y después de un protocolo de entrenamiento.
Los pasos descritos en este protocolo proporcionan suficiente detalle para que el principiante planifique sus propios cultivos neuronales en los AAM y registre la actividad de la red. Este protocolo ayudará a asegurar que los cultivos se adhieran correctamente, formando una capa de alfombra de células sobre las matrices de electrodos, y permanezcan saludables y libres de contaminantes durante meses.
Aunque es mejor adherirse a todas las partes del protocolo, hay pasos a lo largo del proceso que son críticos para el resultado exitoso. El uso de la técnica aséptica a lo largo de todo el proceso es imprescindible para evitar que los cultivos se contaminen. Los nuevos MEA deben hacerse hidrófilos, como se describe en el protocolo, o bien se producirá una pobre adhesión celular. Evitar el pipeteado áspero y la formación de burbujas de aire durante la disociación reducirá el número de células dañadas plateadas y conducirá a un rendimiento más alto y más saludable. Cambiar de DMEM 5/5 a DMEM + después de la primeraLa alimentación también es importante. DMEM 5/5 contiene suero de caballo, lo que hará que las células gliales dominen el cultivo si se usan continuamente y resultará en una mala actividad neuronal, aunque los cultivos parezcan saludables 17 . La alimentación de los cultivos según lo programado y mantenerlos en condiciones de incubación adecuadas también es crucial.
Plating culturas de células en AMAs implica muchas variables que pueden conducir a menos de lo óptimo resultados. Aunque el objetivo es una "alfombra" perfecta de las células, la falta de abordar los pasos críticos mencionados anteriormente dará lugar a la maduración celular pobres o en la contaminación. La mala adherencia celular, que es diferente de la maduración pobre de la célula, es también una preocupación. Esto puede ser causado por varios factores, incluyendo la preparación pobre de MEA antes de la galjanoplastia o el uso del medio viejo. Si el medio antiguo contiene una forma estabilizada de L-glutamina y un suplemento libre de suero para el cultivo de células neurales (véase Tabla de Materiales), Las células inicialmente se adhieren, pero luego se alejan después de aproximadamente dos semanas. Si la contaminación bacteriana es un problema persistente, puede agregarse al medio un antibiótico, tal como ampicilina o pen- strep. También hay fungicidas disponibles para tratar la contaminación por hongos. Estas son algunas de las variables más comunes que pueden afectar el resultado de los cultivos. Hay muchos otros que sólo se encontrará después de tiempo y experiencia.
En comparación con el uso de microelectrodos de vidrio, esta técnica es excelente para estudiar la dinámica de la red y las respuestas farmacológicas. Permite el uso de muchos patrones de estimulación espacio-temporal diferentes y permite el registro de respuestas neuronales de múltiples áreas a la vez. Los grupos anteriores han demostrado interesantes resultados utilizando protocolos similares a los descritos aquí [ 18] . Dado que las culturas duran semanas o meses y las mismas culturas pueden reutilizarse, esta técnicaPara múltiples experimentos a lo largo del tiempo en la misma red.
Sin embargo, hay limitaciones a esta técnica. Los AME no son invasivos. Por lo tanto, sólo pueden registrar la actividad extracelular, en oposición a la fijación de parche o registro intracelular con pipetas. Además, puesto que cada electrodo en una matriz está cubierto por varias células, no es posible resolver la actividad de una sola neurona. Por el contrario, debido a que estos son cultivos in vitro , no pueden reproducir plenamente las propiedades estructurales de las redes en el cerebro. Además, la actividad sólo se puede registrar durante menos de 30 minutos a la vez sin ningún mecanismo que proporcione una atmósfera de CO 2 para que las células mantengan su equilibrio de pH.
Una vez que se domina esta técnica, se pueden explorar las manipulaciones farmacológicas con o sin estimulación eléctrica. También se pueden diseñar y probar nuevos protocolos para investigar el aprendizaje y la formación de memoria en redes neuronales, junto con pRotocolos para las redes del hipocampo o de la médula espinal. Se han publicado previamente protocolos para la estimulación y capacitación de redes, y algunos de ellos se han desarrollado en protocolos in vivo , como la "adaptación selectiva" propuesta por Eytan et al. 19 . Se probaron varios protocolos. Sin embargo, sólo los resultados de una modificación al procedimiento de tétanos propuesto por Ruaro en 2005 se presentan aquí 14 , 20 .
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias CMMI-1300007. Nos gustaría agradecer a los miembros anteriores del laboratorio, que han ayudado con el diseño de estos protocolos y con el mantenimiento de las culturas durante más de cinco años en la Universidad George Mason: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , El Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera y Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |