Ici, nous présentons une méthode stéréologique, le fractionneur optique, utilisé pour quantifier la formation de nouveaux neurones et leur survie, dans l'hippocampe du rat après une stimulation électroconvulsive. Lorsqu'il est correctement implémenté, la sensibilité et l'efficacité des méthodes stéréologiques garantissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.
Les méthodes stéréologiques sont conçues pour décrire les paramètres quantitatifs sans faire d'hypothèses concernant la taille, la forme, l'orientation et la répartition des cellules ou des structures. Ces méthodes ont été révolutionnaires pour l'analyse quantitative du cerveau des mammifères, dans lequel les populations de cellules volumétriques sont trop élevées pour compter manuellement, et la stéréologie est maintenant la technique de choix chaque fois que des estimations de quantités tridimensionnelles doivent être extraites des mesures à deux dimensions sections. Toutes les méthodes stéréologiques sont en principe impartiales; Cependant, ils s'appuient sur une connaissance appropriée de la structure d'intérêt et des caractéristiques du tissu. La stéréologie est basée sur l'échantillonnage homogène systématiquement aléatoire (SURS), avec un ajustement de l'échantillonnage au niveau le plus efficace en matière de précision, fournissant des informations quantitatives et fiables sur toute la structure d'intérêt. Ici, nous présentons le fractionneur optique en conjonction avec l'immunohistochimie BrdU tO estiment la production et la survie des neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires (y compris la zone sous-granulaire) de l'hippocampe de rat après stimulation électroconvulsive, qui est parmi les stimulateurs les plus puissants de la neurogenèse. La technique du fractionneur optique est conçue pour fournir des estimations du nombre total de cellules provenant de sections épaisses échantillonnées à partir de la structure complète. Les sections épaisses offrent l'opportunité d'observer les cellules dans leur totalité en 3-D, ce qui permet une classification cellulaire simple et robuste basée sur des critères morphologiques. Lorsqu'il est correctement implémenté, la sensibilité et l'efficacité du fractionneur optique fournissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.
La quantification des cellules dans une structure tridimensionnelle (3-D) peut nécessiter l'obtention d'estimations basées sur des principes impartiaux. Même aujourd'hui, les études utilisent fréquemment des méthodes bidimensionnelles (2-D) pour signaler les données des structures 3-D. Cependant, ces méthodes ne considèrent pas la nature hétérogène de la structure en termes de forme et de distribution des cellules, ce qui entraîne des limites méthodiques; Ils font des hypothèses au sujet de la structure d'intérêt 3-D et les résultats ne font pas référence à la structure complète. Ces limitations réduisent la sensibilité et la précision des méthodes et augmentent le risque d'erreurs 1 .
Le biais dans le comptage des cellules peut être évité par l'application de la stéréologie basée sur le design, qui est d'une importance générale pour obtenir des informations quantitatives sur le nombre de cellules dans un tissu ou une structure donné. Alors que la stéréologie était autrefois une méthode très longue, les progrès dans les procédures, les doucesWare et l'imagerie, l'a rendu plus efficace et largement applicable. La stéréologie implique des principes d'échantillonnage statistique et une théorie géométrique stochastique pour fournir des outils efficaces pour l'estimation du volume, de la surface, de la longueur et du nombre d'objets dans une structure 3-D par échantillonnage dans les sections 2 -D 2 . Ainsi, la stéréologie permet d'obtenir des données quantitatives impartiales sur les changements structurels dans les sections de tissus, ce qui donne des estimations moyennes du nombre réel, sans analyse exhaustive 1 . La stéréologie est définie comme l'inférence statistique des paramètres géométriques à partir des informations échantillonnées. Cela peut être réalisé par un échantillonnage impartial, c'est-à-dire un échantillonnage aléatoire systématique, des sections ainsi que des règles de comptage qui garantissent que tous les objets ont des probabilités égales d'être comptés 3 . Bien que les résultats stéréologiques puissent avoir des degrés de précision différents, comme indiqué par le coefficient d'erreur (CE), cela peut être une publicitéEn fonction de la variance biologique inhérente (coefficient de variance (CV)) en ajustant la quantité d'échantillonnage requise 4 , 5 . Quelques études stéréologiques antérieures ont examiné les effets à court terme de la stimulation électroconvulsive (ECS) sur la plasticité de l'hippocampe chez les rongeurs 6,7 . Les données de ces études montrent une augmentation initiale du nombre total de neurones ainsi qu'une différenciation synaptique élevée suite à une ECS répétée. Cependant, ces études n'examinent pas directement la neurogénèse, car elles n'utilisent pas de marqueurs spécifiques pour la prolifération cellulaire.
Nous présentons ici une application d'une méthode stéréologique, la technique du fractionneur optique 8 , 9 , pour quantifier le nombre total de neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires d'hippocampe de rat (GCL), y compris la zone sous-granulaire (SGZ) Comme leur long termeUrvival 10 , 11 . Nous avons soumis les rats à un calendrier clinique pertinent de ECS (trois fois par semaine pendant 3 semaines), qui est l'un des stimulants les plus puissants de la neurogénèse 12 . Les animaux de contrôle ont été traités en utilisant la même procédure, mais sans passage de courant. Sur chacun des 21 jours d'expérimentation, tous les rats ont été injectés par voie intrapéritonéale avec 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) qui incorpore dans l'ADN à la place de la thymidine pendant la division cellulaire 13 . Après l'expérimentation, les rats ont été maintenus pendant quatre périodes différentes (24 heures, 3 mois, 6 mois et 12 mois). En utilisant le principe du fractionneur, nous avons obtenu une fraction connue de l'hippocampe à l'aide d'un échantillonnage aléatoire uniforme des sections et des disques optiques appliqués (sondes 3-D) aux sections de tissu épais échantillonnées et immunostained. Il est particulièrement remarqué que les sections congelées s'effondrent habituellement dans l'axe z pendant le processusIng, et que les disques optiques basés sur l'épaisseur moyenne pondérée en nombre de la section devraient être utilisés dans ce cas particulier 14 . Comme le plan focal des disecteurs optiques a été déplacé une distance connue vers le bas à travers la section, les neurones BrdU-positifs ont été comptés quand leur caractéristique d'intérêt était clairement reconnue. Dans le domaine de la stéréologie, il y a un certain débat sur le nombre total de particules qui doivent être comptées 15 ; Typiquement 150-200 neurones sont comptés dans la structure d'intérêt pour obtenir une précision adéquate, c'est -à- dire un coefficient de 7-8% 8 . Les comptes neuronaux positifs pour BrdU ont été complétés en utilisant un logiciel stéréologique avec imagerie par un microscope standard équipé d'une caméra et les objectifs suivants: 2X, 4X et 10X, ainsi qu'un objectif 100X d'immersion en huile (ouverture numérique = 1.40) et un étage motorisé . Les mouvements dans la direction z ont été mesurés avec un microcateur numérique. Le grossissement finalÉtait 3000X.
En utilisant ECS comme une méthodologie pour induire la neurogénèse, on trouve une augmentation immédiate de 260% dans la formation de nouveaux neurones BrdU positives dans l'hippocampe. Dans ce bassin de neurones générés de façon aiguë, nous avons trouvé 40% d'attrition du 1er au trois mois, avec près de 50% des neurones nouvellement formés survivent au moins 12 mois après le traitement 10 , 11 . Le comptage des neurones marqués par BrdU a suivi un schéma d'échantillonnage strict, dans lequel l'ensemble de l'hippocampe a été coupé dans des sections de 80 μm d'épaisseur suivies d'un sous-échantillonnage de chaque 5ème section avec un départ d'échantillonnage aléatoire entre la section un et la section cinq. La fourniture de ces sections est choisie d'une manière aléatoire systématique, ceci est manifestement une excellente méthode pour réduire la variance du résultat final, sans comptage exhaustif 1 . Ce schéma d'échantillonnage nous a permis de compter les neurones BrdU-positifs en moyenne de 12 (8-16) hippocampAl dans chaque cerveau de rat, avec une précision finale de 9 à 11%.
Lors de l'utilisation de la méthode du fractionneur, il est essentiel de connaître la fraction de la hauteur de section dans laquelle le comptage est effectué, car le retrait et la déformation des tissus se produisent fréquemment lors du traitement histologique 14 . En effet, nous avons constaté un important retrait de l'épaisseur dans cette étude. En outre, il convient de noter que le retrait différentiel du tissu peut se produire, tel que présenté dans Dorph-Petersen et al. 2001. Cependant, tant que la structure d'intérêt complète est disponible pour l'analyse, ces limitations n'entraînent pas une polarisation du nombre total de particules, c'est -à- dire des neurones positifs pour BrdU. Dans les études où le retrait des tissus est un problème particulier, il faut toujours dire que les résultats sont obtenus dans des tissus déformés. Dans cette étude, nous avons compté une hauteur de 10 μm. Les sections de la présente étude avaient une épaisseur moyenne finale de 26 μm, un 5 μmZone de protection en haut et une zone de protection de 11 μm (moyenne) au bas de la section. Ces paramètres sont acceptables car les zones de protection devraient être approximativement du diamètre des particules échantillonnées.
Après la délimitation de la GCL / SGZ, les disecteurs ont été répartis de manière uniforme au hasard dans la zone délimitée. Les disecteurs doivent être positionnés avec une longueur d'étape fixe qui optimise l'échantillonnage et le comptage pour obtenir des estimations efficacement avec une précision déterminée par l'enquêteur. La précision optimale est habituellement atteinte en comptant jusqu'à 150-200 cellules dans chaque structure d'intérêt 5 . Dans la présente étude, nous avons compté un moyen de 133 (gamme 33-372) de neurones BrdU positives dans chaque hippocampe de rat. En raison d'un faible nombre de cellules chez certains des animaux de contrôle, nos comptages de neurones BrdU positifs sont tombés en dessous du nombre généralement acceptable de cellules nécessaires pour obtenir une précision appropriée, ce qui a entraîné des valeurs CE relativement élevées pour ces cas. HCependant, comme nous avons obtenu des valeurs CE de moins de la moitié des valeurs CV (voir la section de résultats représentatifs), l'échantillonnage et le comptage supplémentaires n'étaient pas nécessaires. Les valeurs CV élevées montrent que la plus grande contribution à la variation observée provient de la variation biologique. En effet, nous pourrions affirmer que le nombre moyen de neurones BrdU positifs dans la présente étude était plus élevé que nécessaire. Par exemple, dans un groupe de rats, nous avons atteint une valeur CE de 9% et avons observé une valeur CV de 43%. Dans ce cas particulier, nous aurions pu viser une précision d'environ 20%. En résumé, la précision du nombre total de neurones BrdU positifs dans la présente étude est suffisante en ce sens qu'elle capture des effets de traitement réels sur le nombre réel de particules. En raison de la variation biologique assez importante dans certains groupes d'animaux, les mêmes estimations auraient pu être obtenues avec une précision acceptable, en dépit de moins de dépenses d'effort. Les écarts biologiques élevés au sein des groupes ne peuvent queÊtre compensé par l'augmentation du nombre d'animaux.
On pourrait soutenir que l'étalon-or pour l'obtention de nombres de cellules exactes implique un comptage exhaustif de tous les objets d'intérêt. Cependant, dans la plupart des études du cerveau, ce n'est pas une possibilité en raison du grand nombre de cellules. Bien que beaucoup plus efficace que le comptage exhaustif des cellules, le fractionneur optionnel prend beaucoup de temps par rapport au dépistage simple des différences dans le nombre de cellules, ce qui est préférable si le nombre précis de cellules n'est pas essentiel. Notre expérience montre que des différences de plus de 20 à 30% peuvent être détectées uniquement par des procédures de dépistage.
Si elle est effectuée correctement, l'échantillonnage utilisant une stéréologie basée sur le design fournit des estimations impartiales et précises de manière efficace 1 . La propriété impartiale de la stéréologie produit des estimations qui, lorsqu'elles sont répliquées, s'approchent de la vraie population, et améliorent la reproductibilité de laEstimation 21 . Dans un premier temps, un échantillon représentatif de l'ensemble de la structure d'intérêt (dans cette étude, GCL / SGZ hippocampique) doit être obtenu, ce qui permet d'estimer dans un sous-ensemble statistiquement valide des sections 4 . Pour obtenir un nombre approprié de sections et de sondes de comptage, nous appliquons SURS, ce qui réduit la variance par rapport à l'échantillonnage aléatoire 8 . En outre, SURS garantit que les particules d'intérêt dans la structure sont échantillonnées avec les mêmes probabilités, indépendamment de leur taille, leur forme, leur orientation et leur répartition dans la structure. En tant que telle, la stéréologie doit être fortement recommandée lorsque l'on obtient des estimations précises et impartiales est un aspect central du projet.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Susanne Sørensen pour l'assistance technique habile. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Velux; La fondation Jascha; Fondation Aase et Ejnar Danielsens; Hartmann Brothers Foundation; Directeur Jacob Madsen et Fondation Olga Madsens; Docteur Sofus Carl Emil Friis et femme Doris Friis 'Trust; La fondation de 1870; Fondation Torben et Alice Frimodts et Fondation pour la recherche neurologique. L'édition de manuscrit a été effectuée par Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |