Здесь мы представляем стереологический метод – оптическую фрактатор, используемый для количественной оценки образования новых нейронов и их выживания в гиппокампе крысы после электросудорожной стимуляции. При правильной реализации чувствительность и эффективность стереологических методов обеспечивают точные оценки с фиксированной и заданной точностью.
Стереологические методы предназначены для описания количественных параметров без предположений о размере, форме, ориентации и распределении клеток или структур. Эти методы были революционными для количественного анализа мозга млекопитающих, в которых популяции объемных клеток слишком велики для подсчета вручную, а стереология теперь является методом выбора, когда оценки трехмерных величин необходимо извлекать из измерений на двумерных разделы. Все стереологические методы в принципе беспристрастны; Однако они полагаются на правильное знание о структуре интереса и характеристиках ткани. Стереология основана на систематической равномерной случайной выборке (SURS) с корректировкой выборки на наиболее эффективный уровень точности, обеспечивая достоверную количественную информацию обо всей представляющей интерес структуре. Здесь мы представляем оптическую фракцию в сочетании с иммуногистохимией BrdU tO оценить производство и выживание новообразованных нейронов в слое гранулированных клеток (включая субгранулярную зону) гиппокампа крысы после электросудорожной стимуляции, которая является одним из наиболее мощных стимуляторов нейрогенеза. Метод оптической фракции предназначен для оценки общего количества ячеек из толстых участков, отобранных из полной структуры. Толстые участки обеспечивают возможность наблюдения клеток в их полной трехмерной степени и, таким образом, обеспечивают легкую и надежную классификацию клеток на основе морфологических критериев. При правильной реализации чувствительность и эффективность оптического дробления обеспечивают точные оценки с фиксированной и заданной точностью.
Количественная оценка клеток в трехмерной (трехмерной) структуре может потребовать получения оценок на основе объективных принципов. Даже сегодня в исследованиях часто используются двумерные (2-мерные) методы для представления данных трехмерных структур. Однако эти методы не учитывают гетерогенный характер структуры с точки зрения формы и распределения ячеек, что приводит к методическим ограничениям; Они делают предположения о представляющей интерес трехмерной структуре, и результаты не относятся к полной структуре. Эти ограничения уменьшают чувствительность и точность методов, а также увеличивают риск ошибок 1 .
Смещение в подсчете клеток можно избежать путем применения основанной на дизайне стереологии, которая имеет общее значение для получения количественной информации о количестве клеток в данной ткани или структуре. Хотя стереология ранее была очень трудоемким методом, прогресс в процедурах, мягкийИзделий и изображений, сделало его намного более эффективным и широко применимым. Стереология влечет за собой принципы статистической выборки и стохастической геометрической теории, чтобы обеспечить эффективные инструменты для оценки объема, площади поверхности, длины и количества объектов в трехмерной структуре путем отбора проб в двухмерных разделах 2 . Таким образом, стереология позволяет получить объективные количественные данные о структурных изменениях в срезах тканей, которые дают средние оценки истинных чисел без исчерпывающего анализа 1 . Стереология определяется как статистический вывод геометрических параметров из выборочной информации. Это может быть достигнуто путем беспристрастной выборки, то есть систематической случайной выборки, секций, а также правил подсчета, которые гарантируют, что все объекты имеют равные вероятности подсчета 3 . Хотя стереологические результаты могут иметь различную степень точности, как указано коэффициентом ошибки (CE), это может быть объявлениеОправдано в соответствии с присущей биологической дисперсией (коэффициент дисперсии (CV)) путем корректировки количества выборки по мере необходимости 4 , 5 . В нескольких предыдущих стереологических исследованиях были рассмотрены краткосрочные эффекты электросудорожной стимуляции (ECS) на пластичность гиппокампа у грызунов 6,7 . Данные этих исследований показывают начальное увеличение общего числа нейронов, а также повышенную синаптическую дифференцировку после повторных ECS. Однако эти исследования не оценивают непосредственно нейрогенез, так как они не используют специфические маркеры для пролиферации клеток.
Здесь мы представляем применение стереологического метода, метода оптической фракции 8 , 9 , для количественного определения общего количества вновь образованных нейронов в слое клеток гранулы гиппокампа крысы (GCL), включая субгранулированную зону (SGZ), а также Поскольку их долгосрочныеUrvival 10 , 11 . Мы подвергли крыс клиническому соответствующему графику ECS (три раза в неделю в течение 3 недель), который является одним из наиболее мощных стимуляторов нейрогенеза 12 . Контрольные животные обрабатывали с использованием той же процедуры, но без прохождения тока. В каждый из 21 дней экспериментов всем крысам вводили внутрибрюшинно 5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU), который включал в ДНК вместо тимидина во время деления клеток 13 . После экспериментов крыс поддерживали в течение четырех разных периодов времени (24 часа, 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев). Используя принцип фракционирования, мы получили известную фракцию гиппокампа путем равномерной случайной выборки сечений и примененных оптических детекторов (3-D зондов) к выборочным и иммуноокрашенным толстым участкам ткани. Особенно отмечено, что замороженные участки обычно разрушаются по оси z во время процессаИ что в этом конкретном случае следует использовать оптические индикаторы, основанные на толщины среднего среднего сечения. По мере того, как фокальная плоскость оптических детекторов перемещалась на известное расстояние вниз по сектору, BrdU-положительные нейроны подсчитывались, когда их особенность, представляющая интерес, была четко распознана. В области стереологии есть некоторые дебаты об общем количестве частиц, которые должны быть подсчитаны 15 ; Обычно 150-200 нейронов подсчитываются в интересующей структуре для получения адекватной точности, т.е. коэффициента 7-8% 8 . Количество положительных нейронов BrdU было завершено с использованием стереологического программного обеспечения с визуализацией с помощью стандартного микроскопа, оснащенного камерой, и следующих целей: 2X, 4X и 10X, а также 100-процентный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура = 1,40) и моторизованный этап , Движения в направлении z измерялись цифровым микрокатором. Окончательное увеличениеБыл 3000X.
Используя ECS как методологию для индукции нейрогенеза, мы обнаруживаем немедленное увеличение 260% в формировании новых BrdU-положительных нейронов в гиппокампе. В этом пуле остро продуцируемых нейронов мы обнаружили 40% истощения с 1-го по 3-й месяц, причем почти 50% новообразованных нейронов выжили по крайней мере через 12 месяцев после лечения 10 , 11 . Считание нейронов с маркировкой BrdU следовало строгой схеме выборки, в результате чего весь гиппокамп разрезался на секции толщиной 80 мкм с последующей выборкой каждой пятой секции с случайным началом выборки между первой и пятой секциями. Предоставление этих разделов выбирается систематически случайным образом, это, безусловно, отличный способ уменьшить дисперсию конечного результата без исчерпывающего подсчета 1 . Эта схема выборки позволила нам подсчитать BrdU-положительные нейроны в среднем 12 (8-16) гиппокампаВ каждом мозге крысы с конечной точностью 9-11%.
При использовании метода фракционирования важно знать фракцию высоты сечения, в которой выполняется подсчет, поскольку усадка и деформация ткани часто возникают при гистологической обработке 14 . Действительно, в этом исследовании мы наблюдали существенную усадку толщины. Кроме того, следует отметить, что может произойти дифференциальная усадка ткани, как представлено в Dorph-Petersen et al. 2001. Однако, пока полная аналитическая структура представляет интерес, эти ограничения не приводят к смещению общего числа частиц, то есть BrdU-положительных нейронов. В исследованиях, где усадка тканей является особой проблемой, всегда следует указать, что результаты получены в деформированной ткани. В этом исследовании мы подсчитали на высоте рассеивателя 10 мкм. Сечения настоящего исследования имели конечную среднюю толщину 26 мкм, 5 мкмЗащитной зоны вверху и средней защитной зоны 11 мкм в нижней части секции. Эти параметры приемлемы, поскольку защитные зоны должны быть приблизительно диаметра частиц, отобранных для отбора проб.
После разграничения GCL / SGZ, детекторы были равномерно рандомизированы в пределах выделенной области. Детекторы должны располагаться с фиксированной длиной шага, которая оптимизирует выборку и подсчет, чтобы эффективно получать оценки с точностью, определенной исследователем. Оптимальная точность обычно достигается путем подсчета до 150-200 клеток в каждой представляющей интерес структуре 5 . В настоящем исследовании мы подсчитали среднее значение 133 (диапазон 33-372) BrdU-положительных нейронов в каждом гиппокампе крысы. Из-за низкого количества клеток у некоторых контрольных животных наш подсчет BrdU-положительных нейронов упал ниже общепринятого количества клеток, необходимых для получения подходящей точности, что привело к относительно высоким значениям CE для этих случаев. ЧАСОднако, поскольку мы получили значения CE менее половины CV-значений (см. Раздел репрезентативного результата), дополнительной выборки и подсчета не требуется. Высокие значения CV показывают, что наибольший вклад в наблюдаемую вариацию исходит из биологических изменений. Действительно, мы могли бы утверждать, что среднее число BrdU-положительных нейронов, подсчитанных в настоящем исследовании, было выше, чем необходимо. Например, у одной группы крыс мы достигли значения СЕ 9% и наблюдали CV-значение 43%. В этом конкретном случае мы могли бы ориентироваться на точность около 20%. Таким образом, точность общего количества BrdU-положительных нейронов в настоящем исследовании достаточна для того, чтобы фиксировать реальные эффекты воздействия на истинное количество частиц. Из-за довольно большого биологического разнообразия в определенных группах животных одни и те же оценки могли быть получены с приемлемой точностью, несмотря на меньшую затрату усилий. Высокие биологические отклонения внутри групп могутКомпенсируется увеличением числа животных.
Можно утверждать, что золотой стандарт для получения точных номеров клеток влечет за собой исчерпывающий подсчет всех объектов, представляющих интерес. Однако в большинстве исследований головного мозга это не является возможным из-за большого количества клеток. Хотя намного эффективнее, чем исчерпывающий подсчет клеток, необязательная фракционирующая единица занимает относительно много времени по сравнению с простым скринингом различий в количестве клеток, что является предпочтительным, если точное количество клеток не является существенным. Наш опыт показывает, что различия более чем на 20-30% могут быть обнаружены чисто процедурами скрининга.
Если выполнить правильно, выборка с использованием стереоизображений на основе дизайна обеспечивает объективные и точные оценки эффективным образом 1 . Беспристрастное свойство стереологии дает оценки, которые при тиражировании приближают истинное значение популяции и повышают воспроизводимостьОценка 21 . Первоначально должен быть получен репрезентативный образец всей представляющей интерес структуры (в этом исследовании должен быть получен гиппокамп GCL / SGZ), что позволяет оценивать в статистически достоверном подмножестве разделов 4 . Чтобы получить соответствующее количество разделов и подсчет зондов, мы применяем SURS, что уменьшает дисперсию по сравнению со случайной выборкой 8 . Кроме того, SURS гарантирует, что частицы, представляющие интерес в структуре, отбираются с одинаковыми вероятностями, независимо от их размера, формы, ориентации и распределения в структуре. Поскольку такую стереологию следует настоятельно рекомендовать, когда получение точных и непредвзятых оценок является центральным аспектом проекта.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Susanne Sørensen за квалифицированную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Фонда The Velux; Фонд Яша; Aase и Ejnar Danielsens Foundation; Фонд братьев Хартманн; Директор Джейкоб Мэдсен и жена Ольга Мадсенс; Доктор Софус Карл Эмиль Фриис и жена Дорис Фрайс; Фонд 1870 года; Фонда Торбена и Алисы Фримодтса и Фонда неврологических исследований. Редактирование рукописей было выполнено Ingewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |