تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء
Summary
يصف هذا البروتوكول فصل المجمعات الوظيفية سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا (سك) الرابع و سوبيركومبليكسس منها باستخدام الكهربائي الأصلي للكشف عن معلومات حول تجميعها وهيكلها. يمكن أن يتعرض هلام الأم إلى إمونوبلوتينغ، في هلام المقايسات، وتنقية عن طريق إليكترولوتيون لمزيد من وصف المجمعات الفردية.
Abstract
سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا (إتك) يحول الطاقة المستمدة من انهيار أنواع الوقود المختلفة في العملة الحيوية الحيوية للخلية، أتب. ويتكون إتك من 5 مجمعات بروتينية ضخمة، والتي تتجمع أيضا في سوبيركومبلكسيس تسمى ريسبراسوميس (سي، C-إي، و C-إيف) والسينثاسومات (كف) التي تزيد من كفاءة نقل الإلكترون وإنتاج أتب. وقد استخدمت أساليب مختلفة لأكثر من 50 عاما لقياس وظيفة إتك، ولكن هذه البروتوكولات لا توفر معلومات عن تجميع المجمعات الفردية و سوبيركومبلكسس. يصف هذا البروتوكول تقنية هلام الأصلي بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (بادج)، وهي الطريقة التي تم تعديلها منذ أكثر من 20 عاما لدراسة إتك بنية معقدة. يسمح الكهربائي الكهربائي فصل المجمعات إتك في أشكالها النشطة، ويمكن بعد ذلك دراسة هذه المجمعات باستخدام إمونوبلوتينغ، في هلام المقايسات (إيغا)، وتنقية عن طريق إليكترلوتيون. من خلال الجمع بين إعادةوالطبقات من هلام الأم الصفحة مع تلك المقايسات الميتوكوندريا الأخرى، فمن الممكن الحصول على صورة كومبلتر من نشاط إتك، والتجمع الديناميكي والتفكيك، وكيف ينظم هذا الهيكل الميتوكوندريا وظيفة. وسيناقش هذا العمل أيضا القيود المفروضة على هذه التقنيات. وباختصار، فإن تقنية الأصلي بادج، تليها إمونوبلوتينغ، إيغا، والكهربائية، المعروضة أدناه، هو وسيلة قوية للتحقيق في وظائف وتكوين الميتوكوندريا الخ سوبيركومبلكسس.
Introduction
الطاقة الميتوكوندريا في شكل أتب ليست ضرورية فقط لبقاء الخلية، ولكن أيضا لتنظيم موت الخلايا. ويتطلب توليد أتب بواسطة الفسفرة المؤكسدة سلسلة نقل إلكترون وظيفية (إتك؛ سك-I إلى إيف) وميتوكوندريا أتب سينثاس (سك-V). وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن يتم تنظيم هذه المجمعات البروتين الكبيرة في سوبيركومبلكسس، ودعا ريسبراسوميس و سينثاسوميس 1 ، 2 . ومن الصعب تحليل التجمع، والديناميات، وتنظيم الأنشطة من هذه المجمعات الضخمة والسوبركومبلكس. في حين قياسات استهلاك الأوكسجين التي اتخذت مع قطب الأكسجين وانزيم المقايسات التي أجريت باستخدام مقياس الطيف يمكن أن تعطي معلومات قيمة عن النشاط معقدة إتك، هذه المقايسات لا يمكن أن توفر معلومات بشأن وجود وحجم وتكوين وحدات فرعية من البروتين معقدة أو سوبيركومبلكسس المعنية. ومع ذلك، فإن تطوير الأزرق وواضح الأصلي (BN و ن، على التوالي) وقد خلقت الصفحة 3 أداة قوية للكشف عن معلومات هامة حول تكوين معقدة والتجميع / التفكيك وعن التنظيم الديناميكي للمنظمة سوبرامولكولار من هذه المجمعات التنفسية الحيوية تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية 4 .
ويبدو أن تجميع هذه المجمعات في سوبيركومبلكسس أعلى ترتيب لتنظيم هيكل الميتوكوندريا وظيفة 5 . على سبيل المثال، التجمع ريسبراسوم يزيد من كفاءة نقل الإلكترون وتوليد قوة الدافع البروتون عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا 5 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن تجميع سينثاسوميس ليس فقط يزيد من كفاءة إنتاج أتب ونقل معادلات الطاقة في السيتوبلازم 2 ، ولكنه أيضا قوالب الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في كريستي أنبوبي 6 ، </ سوب> 7 . الدراسات من التجمع سوبيركومبلكس خلال التطور القلبي في الأجنة الماوس تظهر أن جيل من سوبيركومبلكسس التي تحتوي على سك-I في القلب يبدأ في حوالي يوم الجنينية 13.5 8 . وقد أظهرت أخرى أن كمية من سكس-I-سوبيركومبلكسس التي تحتوي على نقصان في القلب بسبب الشيخوخة أو نقص التروية / إصابات ضخه 9 ، 10 أو قد تلعب دورا في تطور الأمراض العصبية 11 .
يصف هذا البروتوكول طرق هلام الأم الصفحة التي يمكن استخدامها للتحقيق في التجمع والنشاط من المجمعات إتك و سوبيركومبلكسس. ويمكن تقييم الوزن الجزيئي التقريبي لل سوبيركومبلكسس الميتوكوندريا عن طريق فصل المجمعات البروتين في المواد الهلامية بولي أكريلاميد ن أو بن. ن صفحة كما يسمح لتصور النشاط الأنزيمي من جميع المجمعات الميتوكوندريا مباشرة في هلام (في هلام المقايسات.إيغا) 12 . هذا العمل يدل على نشاط ريسبراسوميس من خلال تسليط الضوء على قدرة سك-I لأكسدة ناد من خلال إيغا ووجود سينثاسوميس بسبب النشاط أتب-هدروليزينغ من سك-V من قبل إيغا. ويمكن أيضا أن تظهر المجمعات متعددة و سوبيركومبلكسس التي تحتوي على سك-I و سك-V عن طريق نقل البروتينات على الأغشية النتروسليلوز وأداء إمونوبلوتينغ. ميزة هذا النهج هو أن بن أو ن صفحة عموما يفصل المجمعات البروتين على أساس حجمها الفسيولوجية وتكوينها؛ نقل إلى غشاء يحافظ على هذا النمط من العصابات. تحليل المجمعات البروتين في بن أو ن صفحة يمكن أيضا أن يتم باستخدام 2D-بادج (انظر فيالا وآخرون 13 لمظاهرة) أو عن طريق السكروز كثافة الطرد المركزي 14 ، 15 . لمزيد من تحليل فرقة محددة، فإنه يمكن استئصاله من بن صفحة، والبروتينات من هذا البروتين يمكن أن يكون بوريفيد عن طريق إلكترويلوتينغ لهم في ظل الظروف المحلية. يمكن إجراء إلكترلوشن المحلية في غضون ساعات قليلة، والتي يمكن أن تحدث فرقا كبيرا في الانتشار السلبي (كما هو مستخدم في المرجع 16) من البروتينات من هلام في المخزن المؤقت المحيطة بها.
وباختصار، تصف هذه الأساليب العديد من النهج التي تسمح لتوصيف المزيد من سوبيركومبلكسس عالية الوزن الجزيئي من الأغشية الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
و إتك وظيفية ضروري لتوليد أتب الميتوكوندريا. مجمعات إتك قادرة على تشكيل نوعين من سوبيركومبليكسس: ريسبراسوميس (سك-I، -III، و- إيف) 1 و سينثاسوميس (سك-V) 2 . التجمع من كل مجمع مطلوب ل إتك سليمة، في حين يعتقد أن تنظيم إتك في سوبيركومبلكسس لزيادة كفاءة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة مؤسس جمعية القلب الأمريكية [12GRNT12060233] ومركز أبحاث الأطفال القوي في جامعة روتشستر.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
