Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения
Summary
Этот протокол описывает разделение функциональных комплексов транспортной цепи митохондриальных электронов (Cx) IV и их суперкомплексов с использованием нативного электрофореза для раскрытия информации об их сборке и структуре. Нативный гель можно подвергать иммуноблоттингу, в-гель-анализе и очищать путем электроэлюции для дальнейшего характеристики отдельных комплексов.
Abstract
Транспортная цепь митохондриального электрона (ETC) трансдуцирует энергию, полученную в результате пробоя различных видов топлива в биоэнергетическую валюту клетки, АТФ. ETC состоит из 5 массивных белковых комплексов, которые также собираются в суперкомплексы, называемые респирасомами (CI, C-III и C-IV) и synthasomes (CV), которые повышают эффективность транспорта электронов и производства ATP. В течение более 50 лет для измерения функции ETC использовались различные методы, но эти протоколы не содержат информации о сборке отдельных комплексов и суперкомплексов. В этом протоколе описывается методика электрофореза на основе полиакриламидного геля на месте (PAGE), метод, который был модифицирован более 20 лет назад для изучения структуры комплекса ETC. Нативный электрофорез позволяет разделять комплексы ETC на их активные формы, и эти комплексы затем могут быть изучены с использованием иммуноблоттинга, в-гель-анализах (IGA) и очистки путем электроэлюции. Объединив reSAGE с исходным гелем PAGE с результатами других митохондриальных анализов, можно получить полную картину активности ETC, ее динамическую сборку и разборку и как это регулирует структуру и функцию митохондрий. В этой работе также будут обсуждаться ограничения этих методов. Таким образом, техника нативного PAGE с последующим иммуноблоттингом, IGA и электролечением, представленная ниже, является мощным способом исследования функциональности и состава суперкомплексов митохондриальных ETC.
Introduction
Митохондриальная энергия в виде АТФ не только необходима для выживания клеток, но и для регуляции клеточной смерти. Генерация АТФ путем окислительного фосфорилирования требует функциональной транспортной цепи электрона (ETC, Cx-I-IV) и митохондриальной АТФ-синтазы (Cx-V). Недавние исследования показали, что эти крупные белковые комплексы организованы в суперкомплексы, называемые респирасомами и синтасомами 1 , 2 . Трудно проанализировать сборку, динамику и регулирование активности этих массивных комплексов и суперкомплексов. В то время как измерения потребления кислорода, проведенные с помощью кислородного электрода и анализа ферментов, проводимые с использованием спектрофотометра, могут дать ценную информацию о активности комплекса ETC, эти анализы не могут предоставить информацию о составе присутствия, размера и субъединицы белкового комплекса или суперкомплексов. Тем не менее, развитие синего и чистого родного (BN и CN соответственно). СТРАНИЦА 3 создала мощный инструмент для выявления важной информации о сложном составе и сборе / разборке и о динамической регуляции супрамолекулярной организации этих жизненно важных респираторных комплексов в физиологических и патологических условиях.
Сборка этих комплексов в суперкомплексах высшего порядка, по-видимому, регулирует структуру и функцию митохондрий 5 . Например, респираторная сборка повышает эффективность переноса электрона и генерирование движущей силы протона через внутреннюю мембрану митохондрии 5 . Кроме того, сборка синтазомов не только повышает эффективность производства АТФ и перенос энергетических эквивалентов в цитоплазму 2 , но также формирует митохондриальную внутреннюю мембрану в трубчатые кристы 6 , </ Sup> 7 . Исследования суперкомплексной сборки во время развития сердца у эмбрионов мыши показывают, что генерация суперкомплексов Cx-I в сердце начинается примерно с эмбрионального дня 13,5 8 . Другие показали, что количество суперкомплексов, содержащих Cx-I, уменьшается в сердце из-за старения или повреждений от ишемии / реперфузии 9 , 10 или может играть роль в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний 11 .
В этом протоколе описаны методы для основного гелевого PAGE, которые могут быть использованы для исследования сборки и активности комплексов ETC и суперкомплексов. Примерную молекулярную массу митохондриальных суперкомплексов можно оценить путем разделения белковых комплексов на полиакриламидные гели CN или BN. CN PAGE также позволяет визуализировать ферментативную активность всех митохондриальных комплексов непосредственно в геле (in-gel assays;ИГА) 12 . Эта работа демонстрирует активность респирасом, выделяя способность Cx-I окислять NADH через IGA и присутствие синтазомов из-за активности АТФ-гидролиза Cx-V с помощью IGA. Множественные комплексы и суперкомплексы, содержащие Cx-I и Cx-V, можно также продемонстрировать путем переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны и проведения иммуноблоттинга. Преимущество этого подхода состоит в том, что BN или CN PAGE обычно разделяют белковые комплексы на основе их физиологических размеров и состава; Перенос на мембрану сохраняет эту картину полос. Анализ белковых комплексов в BN или CN PAGE также может быть осуществлен с использованием 2D-PAGE (см. Fiala и др. 13 для демонстрации) или центрифугированием плотности сахарозы 14 , 15 . Для дальнейшего анализа конкретной полосы ее можно вырезать из BN PAGE, и белки из этого белкового комплекса могут быть очищеныD путем электроэлюции их в естественных условиях. Наземная электроэлюция может быть выполнена в течение нескольких часов, что может существенно повлиять на пассивную диффузию (как используется в ссылке 16) белков из геля в окружающий буфер.
Таким образом, эти методы описывают несколько подходов, которые позволяют дополнительно характеризовать высокомолекулярные суперкомплексы из митохондриальных мембран.
Protocol
Representative Results
Discussion
Функциональный ETC необходим для генерации митохондриального АТФ. Комплексы ETC способны образовывать два типа суперкомплексов: респирасомы (Cx-I, -III и -IV) 1 и синтазомы (Cx-V) 2 . Сборка каждого комплекса необходима для неповрежденного ETC, в то время как считается, что ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Аффилированного основателя Американской ассоциации сердца [12GRNT12060233] и Сильного детского исследовательского центра в Рочестерском университете.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
