Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering
Summary
Denne protokol beskriver adskillelsen af funktionelle mitokondrieelektrontransportkædekomplekser (Cx) IV og superkomplekser deraf ved anvendelse af nativ elektroforese for at afsløre information om deres samling og struktur. Den native gel kan underkastes immunoblotting, in-gel assays og oprensning ved elektroeluering for yderligere at karakterisere individuelle komplekser.
Abstract
Den mitokondrieelektroniske transportkæde (ETC) transducerer den energi, der stammer fra nedbrydning af forskellige brændstoffer i cellenes bioenergetiske valuta, ATP. ETC består af 5 massive proteinkomplekser, som også samles i superkomplekser kaldet respirasomer (CI, C-III og C-IV) og syntasomer (CV), der øger effektiviteten af elektrontransport og ATP-produktion. Forskellige metoder har været anvendt i over 50 år til at måle ETC-funktion, men disse protokoller giver ikke oplysninger om samling af individuelle komplekser og superkomplekser. Denne protokol beskriver teknikken for native gelpolyacrylamidgelelektroforese (PAGE), en metode, der blev modificeret for mere end 20 år siden for at studere ETC-kompleks struktur. Naturlig elektroforese tillader separation af ETC-komplekser i deres aktive former, og disse komplekser kan derefter undersøges ved anvendelse af immunoblotting, in-gel assays (IGA) og oprensning ved elektroeluering. Ved at kombinere reSulten af indfødt gel PAGE med andre mitokondriale assays, er det muligt at få et komplettere billede af ETC-aktivitet, dens dynamiske montering og demontering, og hvordan dette regulerer mitokondriell struktur og funktion. Dette arbejde vil også diskutere begrænsninger af disse teknikker. Sammenfattende er teknikken af native PAGE, efterfulgt af immunoblotting, IGA og elektroelution, præsenteret nedenfor, en effektiv måde at undersøge funktionaliteten og sammensætningen af mitokondrie ETC superkomplekser.
Introduction
Mitokondriell energi i form af ATP er ikke kun afgørende for celleoverlevelse, men også for regulering af celledød. Genereringen af ATP ved oxidativ phosphorylering kræver en funktionel elektrontransportkæde (ETC, Cx-I til IV) og mitochondriel ATP-syntase (Cx-V). Nylige undersøgelser har vist, at disse store proteinkomplekser er organiseret i superkomplekser, kaldet respirasomer og syntasomer 1 , 2 . Det er udfordrende at analysere samling, dynamik og aktivitetsregulering af disse massive komplekser og superkomplekser. Mens iltforbrugsmålinger taget med en oxygenelektrode og enzymanalyser udført under anvendelse af et spektrofotometer kan give værdifuld information om ETC-kompleks aktivitet, kan disse assays ikke tilvejebringe information vedrørende nærvær, størrelse og subunitsammensætning af proteinkomplekset eller de involverede superkomplekser. Men udviklingen af blå og klar indfødte (BN og CN) PAGE 3 har skabt et kraftfuldt værktøj til at afsløre vigtige oplysninger om kompleks sammensætning og montering / demontering og om den dynamiske regulering af den supramolekylære organisering af disse vitale respiratoriske komplekser under fysiologiske og patologiske forhold 4 .
Sammensætningen af disse komplekser i højere ordenes superkomplekser synes at regulere mitokondriell struktur og funktion 5 . For eksempel øger respirasom-samlingen effektiviteten af elektronoverførsel og genereringen af protonmotivkraft over den mitokondrie indre membran 5 . Derudover øger sammensætningen af syntasomer ikke kun effektiviteten af ATP-produktion og overførslen af energiækvivalenter i cytoplasma 2 , men støtter også den mitokondrie indre membran i den rørformede cristae 6 , </ Sup> 7 . Undersøgelser af superkompleks samling under hjerteudvikling i musembryoer viser, at dannelsen af Cx-I-indeholdende superkomplekser i hjertet begynder på ca. embryonal dag 13,5 8 . Andre har vist, at mængden af Cx-I-holdige superkomplekser falder i hjertet på grund af aldring eller iskæmi / reperfusionsskader 9 , 10 eller kan spille en rolle i udviklingen af neurodegenerative sygdomme 11 .
Denne protokol beskriver metoder til native gel PAGE, som kan bruges til at undersøge samlingen og aktiviteten af ETC-komplekserne og superkomplekserne. Den omtrentlige molekylvægt af mitokondrielle superkomplekser kan vurderes ved at separere proteinkomplekserne i CN- eller BN-polyacrylamidgeler. CN PAGE tillader også visualisering af den enzymatiske aktivitet af alle mitokondriale komplekser direkte i gelen (in-gel assays;IGA) 12 . Dette arbejde demonstrerer aktiviteten af respirasomer ved at fremhæve Cx-I's evne til at oxidere NADH gennem IGA og tilstedeværelsen af syntasomer på grund af ATP-hydrolyserende aktivitet af Cx-V ved IGA. De multiple komplekser og superkomplekser indeholdende Cx-I og Cx-V kan også demonstreres ved at overføre proteinerne til nitrocellulosemembraner og udføre immunoblotting. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at BN eller CN PAGE adskiller generelt proteinkomplekser baseret på deres fysiologiske størrelse og sammensætning; Overførslen til en membran bevarer dette mønster af bånd. Analysering af proteinkomplekser i en BN eller CN PAGE kan også gøres ved anvendelse af 2D-PAGE (se Fiala et al. 13 til en demonstration) eller ved saccharosetæthedscentrifugering 14 , 15 . For yderligere at analysere et specifikt bånd kan det udskilles fra BN PAGE, og proteinerne fra dette proteinkompleks kan være purifieD ved at elektroelutere dem under indfødte forhold. Naturlig elektroeluering kan udføres inden for få timer, hvilket kunne gøre en signifikant forskel for den passive diffusion (som anvendt i reference 16) af proteiner fra en gel i den omgivende buffer.
Sammenfattende beskriver disse fremgangsmåder adskillige fremgangsmåder, der tillader yderligere karakterisering af supermolekylære superkomplekser fra mitokondrie membraner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En funktionel ETC er nødvendig for mitokondrisk ATP generering. ETC's komplekser kan danne to typer superkomplekser: respirasomer (Cx-I, -III og -IV) 1 og syntasomerne (Cx-V) 2 . Samlingen af hvert kompleks er påkrævet for en intakt ETC, mens organisationen af ETC i superkomplekser antages at øge den samlede ETC-effektivitet 5 , 22 . Hvordan disse superkomplekser samles og demonteres, forstås i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association Founders Affiliate [12GRNT12060233] og Strong Children's Research Center ved University of Rochester.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
