Измерение поглощения глюкозы и ответ на стимуляцию инсулина в<em> In Vitro</em> Культурные человеческие первичные миопуты
Summary
В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют скорости поглощения глюкозы. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы.
Abstract
Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Оценка чувствительности к инсулину мышечных клеток имеет большое значение для всех исследований, посвященных изучению метаболизма глюкозы в мышцах и характеризующих метаболические изменения. В мышечных клетках белки транспортера белка глюкозы типа 4 (GLUT4) транслоцируются в плазматическую мембрану в ответ на инсулин, что позволяет массово вводить глюкозу в клетку. Способность мышечных клеток реагировать на инсулин путем увеличения скорости поглощения глюкозы является одним из стандартных показателей для количественной оценки чувствительности мышечных клеток к инсулину. Первичные миотубы человека являются подходящей моделью in vitro , так как клетки поддерживают многие особенности фенотипа донора, включая чувствительность к инсулину. Эта модель in vitro также подходит для тестирования любых соединений, которые могут влиять на чувствительность к инсулину. Измерения скорости поглощения глюкозы в дифференцированных миотубах отражаютЧувствительность к инсулину.
В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют уровни поглощения глюкозы с стимуляцией инсулина и без нее. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки пассивных и активных скоростей переноса глюкозы с использованием радиоактивно меченой [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы ([ 3 H] 2dG). Методы расчета предоставляются для количественного определения активных базальных и стимулированных инсулином скоростей, а также сгибания стимуляции.
Introduction
Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Эта чувствительная к инсулину ткань является основным участком поглощения глюкозы, вызванным стимуляцией инсулина 1 .
При диабете 2 типа резистентность к инсулину наблюдается в нескольких тканях, включая скелетную мышцу, и приводит к превышению нормальной концентрации глюкозы в крови. Таким образом, очень важно определить уровень чувствительности к инсулину этой ткани и ее клеток, независимо от того, является ли цель характеризовать дефект у субъекта или оценить эффективность лечения, направленного на его улучшение. У людей или животных, метод золотого стандарта для оценки чувствительности к инсулину – это гиперинсулинемико-эвгликемический зажим. Введенный DeFronzo в 1979 году 2 и измененный с 3 , 4, тогда метод позволяет количественно измерить все тело aЙ сыворотке крови, измеряемой как скорость глюкозы, которую нужно перфузировать при стимуляции инсулина для поддержания нормальной концентрации глюкозы в крови.
Исследование чувствительности к инсулину также может быть выполнено на уровне клеток с использованием моделей мышц in vitro , а измерение уровня поглощения глюкозы остается эффективным и надежным инструментом для количественной оценки биологической реакции клетки на стимуляцию инсулина 5 , 6 , 7 . Действительно, измерение поглощения глюкозы количественно оценивает биологическую реакцию клеток на стимуляцию инсулина, от связывания инсулина с его рецептором с транслокацией обогащенных GLUT4 везикул и включая внутриклеточные сигнальные и фосфорилирующие каскады 8 .
Это представляет большой интерес для образцов человека, поскольку дифференцированные миотубы поддерживают многие особенности донорского фенотипа, включая метаболическое свойствоИ нарушениями, наблюдаемыми у пациента 9 , 10 , 11 , 12 . Миотубы демонстрируют структурное, метаболическое и фенотипическое сходство с скелетной мышцей 13 , 14 , включая экспрессию транспортеров 15 для глюкозы и аппаратуру сигнализации клеточного инсулина 16 . Таким образом, измерение поглощения глюкозы в первичных миопутах имеет значение для характеристики фенотипа мышц донора или исследования влияния вмешательства (лекарственного средства, питания или физической активности) на чувствительность к инсулину в мышечной клетке.
Измерение поглощения глюкозы на культивируемых миопутах также является надежным инструментом при проведении экспериментов, которые изменяют чувствительность к инсулину 17 , 18 . В пробирке </Em> подходит для испытаний любых соединений, которые могут улучшить чувствительность к инсулину, или могут предотвратить или обратить вспять приобретенную или индуцированную резистентность к инсулину 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Здесь мы описываем подробный протокол к культуре и дифференцируем человеческие миотубы и измеряем уровни поглощения глюкозы клеток. Этот метод применим к любому источнику клеток-предшественников мышечных клеток человека, независимо от того, поступают ли они из лабораторных препаратов, совместной работы или коммерчески доступных поставщиков. Иммертизированные линии мышечных клеток, такие как C2C12 и L6, соответственно, из происхождения мыши и крысы, также могут использоваться для измерения поглощения глюкозы с помощью этого протокола 7 .
Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2dG. TОн использует маркированный глюкозный аналог, позволяющий точно определять введение глюкозы с уменьшенным исходным материалом, обычное условие при работе с первичными клетками. Модифицированная молекула глюкозы неспособна проникать в метаболические пути и, таким образом, накапливается внутри клетки, обеспечивая надежную количественную оценку с помощью полной радиоактивности клеток. Экспериментальные условия включают использование ингибитора транспорта глюкозы (цитохалазин В), а измерения проводятся с инсулином и без него. Эта комбинация позволяет определить уровни активности активного глюкозы, а также расчет изменения смены индекса инсулина. Метод представлен одной дозой инсулина в течение одного времени инкубации, но протокол может быть легко модифицирован для дозозависимых или временных экспериментов 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Поглощение глюкозы является ключевым биологическим измерением для тестирования активаторов или ингибиторов клеточной культуры и того, как они влияют на использование глюкозы, и способность клетки реагировать на инсулин. Описанный здесь метод оказался быстрым и надежным и широко исп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Энн Шарри в службе радиобиологии (больница Лион-Сюд) и Фонд «Национальный суис» (FNS) за финансовую поддержку.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
References
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
