Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra<em> Rhipicephalus microplus</em> Epitelceller
Summary
En centrifugeringsgradientbaseret metode med modificeret densitet blev anvendt til at isolere epithelceller fra Rhipicephalus microplus gutvæv . Overfladebundne proteiner blev biotinyleret og oprenset gennem streptavidinmagnetiske perler til anvendelse i nedstrøms applikationer.
Abstract
Rhipicephalus microplus – kvæget – er den mest betydningsfulde ektoparasit med hensyn til økonomisk indvirkning på husdyr som vektor af flere patogener. Der er sat en indsats på kvægkontrollen for at mindske dens skadelige virkninger, med fokus på opdagelsen af vaccinekandidater, såsom BM86, der er placeret på overfladen af tarmkirtleepitelcellerne. Nuværende forskning fokuserer på udnyttelsen af cDNA og genomiske biblioteker til screening for andre vaccinkandidater. Isoleringen af tarmkanalceller udgør en vigtig fordel ved undersøgelse af sammensætningen af overfladeproteiner på tarmkirtlemembranen. Dette papir udgør en ny og gennemførlig metode til isolering af epithelceller, fra tærskelarmindholdet af semi-engorged R. microplus. Denne protokol anvender TCEP og EDTA for at frigive epithelcellerne fra subepitelialstøttevævene og en diskontinuerlig densitetscentrifugeringsgradieNt til at adskille epithelceller fra andre celletyper. Celleoverfladeproteiner blev biotinyleret og isoleret fra tick-gut-epithelcellerne ved anvendelse af streptavidin-bundet magnetiske perler, der muliggør nedstrømsapplikationer i FACS- eller LC-MS / MS-analyse.
Introduction
Rhipicephalus microplus , kvæget, er den mest betydningsfulde ektoparasit med hensyn til økonomisk indvirkning på kvægindustrien i tropiske og subtropiske regioner, da det er vektorer af kvægfiskfeber (babesiosis), anaplasmosis og equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Der er gjort en indsats for kvægetekskontrol for at mindske den skadelige effekt, men konventionelle metoder som brugen af kemiske acaricider har implicitte ulemper, såsom tilstedeværelsen af kemiske rester i mælk og kød, og stigningen i forekomsten af kemisk resistente flåter 5 , 6 , 7 . Derfor er udviklingen af alternative metoder til tærskekontrol blevet undersøgt, såsom brugen af naturligt resistent kvæg, biologisk kontrol (biopesticider) og vaccineInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
I udøvelsen af proteiner, der kan anvendes som vaccinkandidater, er den aktuelle forskning fokuseret på tarmkanalen. Midgutvæggen er bygget af et enkelt lag epithelceller hvilende på en tynd basal lamina, hvor ydersiden af basal lamina udgør et netværk af muskler. Lys- og elektronmikroskopobservation viser, at midgut består af tre typer af celler: reserve (udifferentieret), sekretorisk og fordøjelseskrævende. Antallet af celletyper varierer betydeligt afhængigt af den fysiologiske fase. Sekretoriske og fordøjelsesceller stammer begge fra reserveceller 18 , 19 , 20 .
Konstruktionen af cDNA-bibliotekerAt undersøge sammensætningen af tarmkanalen har ført til identifikationen af antigeniske proteiner, såsom Bm86, som potentielle vaccinkandidater 2 , 3 , 4 . Glycoproteinet Bm86 er lokaliseret på overfladen af tarmkanalceller og fremkalder et beskyttende immunrespons mod kvægtæppet ( R. microplus ) hos vaccineret kvæg. Anti-Bm86 IgG'er produceret af den immuniserede vært indtages af tæsken, genkender dette antigen på overfladen af tarmkanalceller og forstyrrer efterfølgende tarmvævets funktion og integritet. Vacciner baseret på Bm86 antigener har vist effektiv kontrol af R. microplus og Rhipicephalus annulatus ved at reducere antallet, vægt og reproduktionskapacitet hos hunner, der resulterer i reduceret larveinfektion i efterfølgende trikgenerationer 4 . Bm86-baserede vacciner er dog ikke effektive mod alle fikseringstrin og harViste utilfredsstillende effekt over for nogle geografiske stammer af R. microplus , og derfor har oksekøds- og mejeribranchen dårligt vedtaget disse vacciner 2 , 4 .
Evnen til at isolere epithelceller fra tarmkanalen er en betydelig innovation, der vil muliggøre forskydning af forskning til bestemmelse af proteinmembran-sammensætning, herunder morfologi og fysiologi under forskellige miljømæssige forhold. Fremgangsmåden beskrevet her anvender chelateringsmidlet ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og reduktionsmidlet tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) for at frigive epithelet fra dets subepitheliale bærevæv 10 . Epitelet genvindes efter mekanisk afbrydelse af vævene ved omrystning efterfulgt af diskontinuerlig gradientcentrifugering i Percoll. I dette papir beskrives en gennemførlig og ny teknik til isolering af tarmkirtepiThelleceller. Biotinylerede celleoverfladeproteiner, isoleret fra overfladen af disse epithelceller, kan efterfølgende analyseres i downstream-applikationer, såsom FACS og / eller LC-MS / MS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvægbekæmpelse udgør et stort problem for kvægindustrien i tropiske og subtropiske regioner i verden med den mest almindelige kontrolmetode afhængig af anvendelsen af acaricider 1 , 4 . Bm86 blev tidligere identificeret inden for epiteloverfladen af tarmkirtlen som et beskyttende antigen mod R. microplus infestation 10 med begrænset succes som en vaccinestrategi på grund af Bm86 geografisk sekvensvariation og k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at takke Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australien) til levering af Rhipicephalus microplus ticks anvendt til dette studie, og Lucas Karbanowicz til hjælp med videooptagelse.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
