Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em> Rhipicephalus microplus</em> Células epiteliales intestinales
Summary
Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.
Abstract
Rhipicephalus microplus es el ectoparásito más significativo en términos de impacto económico en el ganado como vector de varios patógenos. Se han dedicado esfuerzos al control de garrapatas para disminuir sus efectos deletéreos, centrándose en el descubrimiento de vacunas candidatas, como la BM86, localizada en la superficie de las células epiteliales de la garrapata. La investigación actual se centra en la utilización de cDNA y bibliotecas genómicas, para seleccionar otras vacunas candidatas. El aislamiento de las células intestinales de garrapatas constituye una ventaja importante en la investigación de la composición de las proteínas de superficie sobre la membrana de las células del intestino de garrapatas. Este trabajo constituye un método novedoso y factible para el aislamiento de células epiteliales, a partir de los contenidos de intestino de garrapata de R. microplus. Este protocolo utiliza TCEP y EDTA para liberar las células epiteliales de los tejidos de soporte subepiteliales y un gradiente de densidad discontinua gradieNt para separar las células epiteliales de otros tipos de células. Las proteínas de la superficie celular fueron biotiniladas y aisladas de las células epiteliales de la tripa de la garrapata, usando perlas magnéticas unidas a estreptavidina permitiendo aplicaciones posteriores en análisis FACS o LC-MS / MS.
Introduction
Rhipicephalus microplus es la ectoparásita más significativa en términos de impacto económico en la industria ganadera de las regiones tropicales y subtropicales, ya que vectores de la fiebre de la garrapata bovina (babesiosis), la anaplasmosis y la piroplasmosis equina 1 , 2 , 3 , 4 . Sin embargo, los métodos convencionales como el uso de acaricidas químicos tienen inconvenientes implícitos, como la presencia de residuos químicos en la leche y la carne, y el aumento de la prevalencia de garrapatas químicamente resistentes 5 , 6 , 7 . En consecuencia, se ha estudiado el desarrollo de métodos alternativos de control de garrapatas, como el uso de resistencia natural bovina, el control biológico (biopesticidas) y la vacunaInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
En la búsqueda de proteínas capaces de ser utilizadas como vacunas candidatas, la investigación actual se centra en la garrapata intestinal. La pared del intestino medio se construye a partir de una sola capa de células epiteliales descansando sobre una fina lámina basal, con el exterior de la lámina basal formando una red de músculos. Las observaciones del microscopio electrónico y de luz indican que el intestino medio consiste en tres tipos de células: reserva (indiferenciada), secretora y digestiva. El número de tipos de células varía considerablemente dependiendo de la fase fisiológica. Las células secretoras y digestivas proceden de células de reserva 18 , 19 , 20 .
La construcción de bibliotecas de cDNAPara examinar la composición de la tripa de la garrapata ha llevado a la identificación de proteínas antigénicas, como Bm86, como potencial vacuna candidatos 2 , 3 , 4 . La glicoproteína Bm86 se localiza en la superficie de las células de la garrapata e induce una respuesta inmune protectora contra la garrapata del ganado vacuno ( R. microplus ). Las IgG anti-Bm86 producidas por el huésped inmunizado son ingeridas por la garrapata, reconocen este antígeno en la superficie de las células del intestino de garrapatas y, posteriormente, alteran la función e integridad del tejido del intestino de garrapata. Las vacunas basadas en antígenos Bm86 han mostrado un control efectivo de R. microplus y Rhipicephalus annulatus, al reducir el número, el peso y la capacidad reproductora de las hembras engorciadoras, lo que resulta en una infestación larval reducida en las generaciones subsiguientes de garrapatas 4 . Sin embargo, las vacunas basadas en Bm86 no son eficaces contra todas lasDemostró una eficacia insatisfactoria frente a algunas cepas geográficas de R. microplus , por lo que las industrias lecheras y de vacuno han adoptado mal estas vacunas 2 , 4 .
La capacidad de aislar las células epiteliales de la tripa de la garrapata es una innovación significativa que permitiría la progresión de la investigación para determinar la composición de la membrana de proteínas, incluyendo la morfología y la fisiología en diferentes condiciones ambientales. El método aquí descrito utiliza el agente quelante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el agente reductor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para liberar el epitelio de sus tejidos de soporte subepitelial 10 . El epitelio se recupera tras la interrupción mecánica de los tejidos por agitación, seguido de centrifugación discontinua en gradiente en Percoll. Este artículo describe una técnica factible y novedosa para el aislamiento de la epi de garrapatasLas células celulares. Las proteínas de superficie celular biotiniladas, aisladas de la superficie de estas células epiteliales pueden analizarse subsiguientemente en aplicaciones aguas abajo tales como análisis FACS y / o LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las infestaciones de garrapatas de ganado constituyen un problema importante para la industria ganadera en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con el método de control más común dependiente del uso de acaricidas 1 , 4 . Bm86 fue identificado previamente dentro de la superficie epitelial del intestino de garrapata como un antígeno protector contra la infestación de R. microplus 10 , con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Colonia Tick de Bioseguridad (Departamento de Agricultura y Pesca de Queensland, Australia) por la provisión de garrapatas Rhipicephalus microplus utilizadas para este estudio, y Lucas Karbanowicz para asistencia con filmación de video.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
